五種中藥注射液對(duì)大鼠體外肝微粒體中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶的影響.pdf

1、目的:一、建立高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)，測(cè)定大鼠體外肝微粒體中對(duì)乙酰氨基酚、1-羥基咪達(dá)唑侖和4-羥基雙氯芬酸的濃度。二、建立大鼠體外肝微粒體孵育體系。選擇非那西丁、咪達(dá)唑侖和雙氯芬酸分別作為CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的特異性探針?biāo)幬?，用高效液相色譜法分別測(cè)定大鼠肝微粒體孵育后相應(yīng)的代謝物（對(duì)乙酰氨基酚、1-羥基咪達(dá)唑侖和4-羥基雙氯芬酸）的濃

2、度，得出三種探針?biāo)幬锏拿竸?dòng)力學(xué)參數(shù)，評(píng)價(jià)CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9三種酶的活性。三、考察五種中藥注射液對(duì)大鼠體外肝微粒體中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶的影響。向孵育系統(tǒng)中分別加入不同濃度的丹參川芎嗪注射液、谷紅注射液、銀杏葉提取物注射液、參麥注射液以及參附注射液，測(cè)定探針?biāo)幬锎x產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚、1-羥基咪達(dá)唑侖和4-羥基雙氯芬酸的濃度，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50，考察五種中藥注射液對(duì)體外肝微粒體中CYP1A2

3、、CYP3A4和CYP2C9酶活性的影響。
　　方法:建立和優(yōu)化高效液相色譜條件:1、測(cè)定大鼠肝微粒體中對(duì)乙酰氨基酚的濃度:柱溫選擇30℃，流速設(shè)定0.8mL·min-1，Hypersil BDS C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)245nm，流動(dòng)相A為乙腈，B為50.0mmol·L-1 Na2HPO4緩沖液(pH4.5)，梯度洗脫;2、測(cè)定大鼠肝微粒體中1-羥基咪達(dá)唑侖的濃度:柱溫選擇30℃，流速設(shè)定1.0mL

4、·min-1，Hypersil BDS C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm;流動(dòng)相A為乙腈，B為10.0mmol·L-1Na2HPO4緩沖液(pH8.4)，梯度洗脫;3、測(cè)定大鼠肝微粒體中4-羥基雙氯芬酸的濃度:柱溫選擇30℃，流速設(shè)定0.8mL·minl，Hypersil BDS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)276nm，流動(dòng)相A為乙腈，B為50.0mmol·L-1 Na2HPO4緩沖

5、液(pH4.5)，等度洗脫。優(yōu)化大鼠肝微粒體孵育體系的蛋白濃度，優(yōu)化孵育時(shí)間。以Lineweaver-Burk為坐標(biāo)求得Km與Vmax值。將不同濃度的丹參川芎嗪注射液、谷紅注射液、銀杏葉提取物注射液、參麥注射液以及參附注射液分別加入到孵育體系中，測(cè)定探針?biāo)幬锎x產(chǎn)物的濃度，評(píng)價(jià)對(duì)三種酶活性的影響，并分別計(jì)算出五種中藥注射液對(duì)CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　結(jié)果:在建立的色譜條件下，探針?biāo)幬?/p>

6、和代謝產(chǎn)物峰形良好，各自內(nèi)標(biāo)亦符合標(biāo)準(zhǔn)，整個(gè)體系中干擾因素較小。對(duì)乙酰氨基酚的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù):Km=102.0μmol·L-1，Vmax=1.05nmol·min-1·mg protein-1;對(duì)乙酰氨基酚線性區(qū)間0.10～49.90μmol/L。處理回收率＞85％，日內(nèi)、日間精密度均＜10％，穩(wěn)定性均＜10％，準(zhǔn)確度在85％～115％區(qū)間內(nèi)。1-羥基咪達(dá)唑侖的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù): Km=57.0μmol·L-1，Vmax=1.05nmol·m

7、in-1·mg protein-1;1-羥基咪達(dá)唑侖線性區(qū)間0.10～29.90μmol/L，處理回收率＞85％，日內(nèi)、日間精密度均＜10％，穩(wěn)定性均＜10％，準(zhǔn)確度在85％～115％區(qū)間內(nèi)。4-羥基雙氯芬酸的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km=16.9μmol·L-1，Vmax=1.26nmol·min-1·mgprotein-1;4-羥基雙氯芬酸線性區(qū)間0.20～29.90μmol/L，處理回收率＞85％，日內(nèi)、日間精密度均＜10％，穩(wěn)定性均＜10％

8、，準(zhǔn)確度在85％～115％區(qū)間內(nèi)。丹參川芎嗪注射液對(duì)CYP1 A2、CYP3A4和CYP2C9無(wú)抑制;谷紅注射液對(duì)CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9無(wú)抑制;銀杏葉提取物注射液對(duì)CYP3A4和CYP2C9的IC50分別為11.48％、12.91％;參麥注射液對(duì)CYP1A2、CYP3A4無(wú)抑制，對(duì)CYP2C9的IC50為3.68％;參附注射液對(duì)CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的IC50分別為4.27％、6.65％、5.23％。

9、
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)采用體外肝微粒體孵育法，通過(guò)探針?biāo)幬?，評(píng)價(jià)大鼠肝微粒體中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶的活性，方法具有操作性、可靠性。通過(guò)建立大鼠肝微粒體孵育體系，考察五種中藥注射液對(duì)CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶活性產(chǎn)生的影響。經(jīng)數(shù)據(jù)整理后發(fā)現(xiàn):丹參川芎嗪注射液在體外對(duì)CYP1 A2、CYP3A4和CYP2C9無(wú)明顯抑制作用;谷紅注射液在體外對(duì)CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9無(wú)明顯抑制作用;銀杏