苯并(a)芘對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞連接蛋白基因表達(dá)的影響.pdf

1、苯并(a)芘(B(a)P)是多環(huán)芳烴的代表物質(zhì)，普遍存在于大氣、土壤與水中。它主要來自于煤焦油，汽車尾氣，各類有機(jī)物產(chǎn)生的煙霧，燒烤食物以及工業(yè)污水中。
　　日常生活中接觸B(a)P主要通過污染空氣的吸入、吸煙以及飲食。
　　B(a)P具致癌性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和生殖毒性。以往關(guān)于B(a)P研究主要集中于致畸、致癌致突變等方面。近年來，生殖健康問題備受關(guān)注。B(a)P具有生殖毒性，它可以引起睪丸萎縮、精子數(shù)量及活動(dòng)能力下降

2、，減低曲細(xì)精管的重量以及減少睪酮水平。但是B(a)P的雄性生殖毒性機(jī)制仍不完全清楚。
　　睪丸連接蛋白對(duì)于構(gòu)成血睪屏障以及精子發(fā)生所需的微環(huán)境所必需，睪丸細(xì)胞通過連接蛋白進(jìn)行著信息和能量物質(zhì)的交換，因此連接蛋白對(duì)睪丸細(xì)胞的增殖、成熟和分化等生理過程起著重要的調(diào)控作用。近年來，連接蛋白在外源化學(xué)物誘導(dǎo)的生殖毒性過程中的作用越來越受關(guān)注。然而在B(a)P的雄性生殖毒性機(jī)制中，B(a)P對(duì)連接蛋白的影響和機(jī)制尚不清楚。
　　本研究

3、擬通過建立體外SD大鼠原代培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞的B(a)P染毒模型，探討B(tài)(a)P對(duì)睪丸支持細(xì)胞連接蛋白基因表達(dá)的變化，分析可能的毒性機(jī)制，為B(a)P雄性生殖風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、危害控制和預(yù)防提供依據(jù)。
　　研宄方法:對(duì)21天大鼠睪丸通過兩步酶消化法分離得到睪丸支持細(xì)胞，通過形態(tài)、細(xì)胞活力和純度鑒定，顯示培養(yǎng)系細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，存活率大于94％，支持細(xì)胞純度大于95％。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用半定量PCR法測(cè)定了B(a)P(0，5，10和25μmol

4、/L)6小時(shí)和12小時(shí)暴露對(duì)支持細(xì)胞連接蛋白mRNA表達(dá)的影響，應(yīng)用酶標(biāo)法測(cè)定了B(a)P染毒對(duì)caspase-3、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHpx)的影響，并通過caspase-3抑制劑和抗氧化劑，分析了caspase-3及B(a)P誘導(dǎo)的氧化損傷對(duì)支持細(xì)胞連接蛋白mRNA表達(dá)的調(diào)控。
　　結(jié)果一: B(a)P對(duì)支持細(xì)胞及連接蛋白mRNA表達(dá)的影響
　　形態(tài)

5、學(xué)觀察顯示B(a)P暴露12小時(shí)后在25μmol/L可引起培養(yǎng)系細(xì)胞的形態(tài)變化，顯示支持細(xì)胞變瘦長(zhǎng)，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，精原細(xì)胞從支持細(xì)胞表面脫落聚集，出現(xiàn)細(xì)胞碎片。
　　染毒時(shí)間為6小時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力有下降趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:染毒時(shí)間為12小時(shí)，隨著染毒劑量的增加，細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)，在濃度為25μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力下降明顯，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　本次研究主要檢測(cè)了緊密連

6、接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1，錨定連接蛋白N-cadherin以及縫隙連接蛋白connexin-43和connexin-26。PCR結(jié)果顯示:在培養(yǎng)系暴露B(a)P6小時(shí)后，隨著劑量的增加，連接蛋白mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)，在25μmol/L時(shí)connexin-43、connexin-26、occludin mRNA表達(dá)下降明顯，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而此劑量下ZO-1和N-cadherin mRNA表達(dá)與對(duì)

7、照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在培養(yǎng)系暴露B(a)P12小時(shí)后，隨著劑量的增加，連接蛋白mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)，在10μmol/L時(shí)，connexin-43、connexin-26、occludin mRNA表達(dá)下降明顯，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在25μmol/L時(shí)ZO-1mRNA表達(dá)下降明顯，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);N-cadherinmRNA表達(dá)有下降趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義。以上結(jié)果提示了connexin-43、connexin-26、occludin mRNA表達(dá)可能更敏感于B(a)P的細(xì)胞活力。
　　結(jié)果二: caspase-3可調(diào)節(jié)B(a)P誘導(dǎo)的支持細(xì)胞連接蛋白mRNA表達(dá)的變化
　　Caspase-3作為凋亡的中樞效應(yīng)器，被認(rèn)為是與凋亡最有關(guān)聯(lián)的酶，在細(xì)胞凋亡的起始和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。B(a)P暴露12小時(shí)后，隨著劑量的增加，caspase-3的活性呈上升趨勢(shì)，且在10μ

9、mol/L和25μmol/L劑量時(shí)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在培養(yǎng)系中加入B(a)P并同時(shí)加入caspase-3抑制劑之后，caspase-3抑制劑拮抗了B(a)P(10μmol/L和25μmol/L)所誘導(dǎo)的caspase-3活性上升，與未染毒B(a)P的對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　加入B(a)P并同時(shí)加入caspase-3抑制劑之后，connexin-43、connexin-26、occludi

10、n和ZO-1的mRNA表達(dá)在10μmol/L和25μmol/L時(shí)誘導(dǎo)的下降受到拮抗，與未染毒B(a)P的對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果三: B(a)P誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激影響支持細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)
　　培養(yǎng)系暴露B(a)P12小時(shí)后，隨著劑量的增加，活性氧(ROS)水平也上升，MDA含量也上升，在B(a)P濃度為10μmol/L和25μmol/L時(shí)，ROS和MDA含量明顯上升，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

11、)。隨B(a)P染毒劑量的增加，抗氧化酶活性下降:在B(a)P濃度為25μmol/L時(shí)，SOD和GSHpx酶活性明顯下降，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在B(a)P濃度為10μmol/L和25μmol/L時(shí)，CAT酶活性明顯下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　加入番茄紅素（lycopene）作為抗氧化劑后，番茄紅素拮抗了B(a)P所誘導(dǎo)的ROS和MDA水平上升，B(a)P+番茄紅素組和未加B

12、(a)P對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)番茄紅素也拮抗了B(a)P染毒所誘導(dǎo)的抗氧化酶活性SOD、GSHpx和CAT活性下降，B(a)P+番茄紅素組和對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與此同時(shí)，番茄紅素也拮抗了B(a)P所形成的連接蛋白connexin-43、connexin-26 occludin和ZO-1的mRNA表達(dá)，和未加B(a)P的對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果提示抗氧化劑可以預(yù)防B(a)P對(duì)支持細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的影響。

13、r>　　結(jié)果四: 聯(lián)合暴露PCB169增強(qiáng)B(a)P對(duì)支持細(xì)胞的毒性及對(duì)連接蛋白表達(dá)的毒作用
　　聯(lián)合暴露PCB169（5μmol/L）和B(a)P（5μmol/L、10μmol/L和25μmol/L）后，發(fā)現(xiàn)在B(a)P為25μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力、MDA、connexin43和occludin mRNA表達(dá)等指標(biāo)中，聯(lián)合暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性高于單獨(dú)暴露B(a)P組，與單獨(dú)暴露組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); PCB16