缺氧預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植減少大鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡并改善心功能.pdf

1、心肌梗死(myocardialinfarction，MI)，是指冠狀動(dòng)脈閉塞血流中斷，部分心肌因嚴(yán)重而持久的缺血而發(fā)生局部壞死，導(dǎo)致了心肌細(xì)胞的不可逆的損傷和丟失以及瘢痕的形成，是引起充血性心力衰竭的主要原因。 急性心肌梗死的治療，早期在于盡快挽救瀕死的心肌防止梗塞面積擴(kuò)大，縮小心肌缺血的范圍。近十年來(lái)，隨著對(duì)于細(xì)胞(stemcells)認(rèn)識(shí)的不斷加深，很多研究認(rèn)為干細(xì)胞具有組織再生的功能，在體內(nèi)能分化成為其他成熟細(xì)胞，如心肌細(xì)

2、胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等等，因此，用干細(xì)胞治療心肌梗死的研究引起了大家的普遍關(guān)注。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一種多能干細(xì)胞，在心肌微環(huán)境中可分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)它們可以釋放促進(jìn)血管生成和抗凋亡的因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepaticgrowthfactor，HGF))和胰島素樣生長(zhǎng)

3、因子(insulin-likegrowthfactor，IGF-1)等，從而激活內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制，然而MSCs移植后的療效不夠理想，其低存活力大大限制了細(xì)胞治療的效果。有研究通過基因修飾可以增強(qiáng)了MSCs的心肌保護(hù)作用，但其安全性和有效性仍然是有爭(zhēng)論的。 以前的報(bào)道表明，缺氧在胎盤的發(fā)育過程中有著及其重要的作用，早期人類胚胎就發(fā)生在一個(gè)非常低的氧濃度的環(huán)境中。MSCs定居的骨髓也是一個(gè)含氧量低的環(huán)境，當(dāng)MSCs的氧濃度減少到5％

4、時(shí)增加了其骨形成的能力，用缺氧刺激MSCs增加了其旁分泌作用。因此我們推測(cè)經(jīng)缺氧預(yù)處理(anoxicpreconditioning，AP)的MSCs，其心臟保護(hù)功能會(huì)進(jìn)一步增加。 研究方法： 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：骨髓MSCs由沖洗雄性的8周SD大鼠的股骨和脛骨骨髓腔并用密度梯度離心法分離獲取。3-5次傳代后貼壁的梭形骨髓MSCs得到擴(kuò)增和純化。移植前用流式細(xì)胞儀對(duì)骨髓MSCs進(jìn)行檢測(cè)。AP-MSCs缺氧(氧濃度<0.5％)3小時(shí)。

5、移植細(xì)胞在體外用細(xì)胞核染料DAPI(50μg/ml)標(biāo)記30分鐘。體重約250g的成年雄性SD大鼠，開胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，建立急性心梗模型。建模成功一周后再次開胸，隨機(jī)分3組，分別在心梗周邊區(qū)分3-5點(diǎn)注射150μlDMEM(n=16)，5×106MSCs/150μl(n=16)，或5×106AP-MSCs/150μl(n=16)。在移植后1周，行TUNEL染色評(píng)估心肌細(xì)胞凋亡，并對(duì)凋亡相關(guān)蛋白信號(hào)通路蛋白的westernblot分

6、析來(lái)評(píng)價(jià)DMEM、MSCs和AP-MSCs三組的心肌細(xì)胞凋亡情況。在移植后4周，采用心臟超聲評(píng)價(jià)大鼠的心功能情況；行HE染色，進(jìn)行心梗面積計(jì)算，血管計(jì)數(shù)。 體外實(shí)驗(yàn)：采用分次消化法分離獲取出生1-3天SD大鼠的心肌細(xì)胞，以差速貼壁法和Brdu抑制法提純心肌細(xì)胞。十天后，心肌細(xì)胞隨機(jī)分為三組進(jìn)行缺氧再?gòu)?fù)氧實(shí)驗(yàn)：DMEM組、MSCs共培養(yǎng)組、AP-MSCs共培養(yǎng)組，缺氧24小時(shí)復(fù)氧3小時(shí)，對(duì)照組在含20％胎牛血清的DMEM中標(biāo)準(zhǔn)條件

7、下培養(yǎng)27小時(shí)，用AnnexinV-FITC法檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果： 1.心肌細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)和鑒定心肌細(xì)胞呈梭形、多角形，具有搏動(dòng)能力；MSCs分離培養(yǎng)至第三代就較純，顯微鏡下幾乎見不到雜質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)粘附分子CD44和CD90，而很少細(xì)胞表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)記CD45，這結(jié)果符合MSCs的特征。 2.MSCs特別是AP-MSCs減少了缺氧再?gòu)?fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

8、正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡率低(2.16±0.78％)，缺氧再?gòu)?fù)氧后，心肌細(xì)胞凋亡明顯增加(21.5±2.71％，vs正常培養(yǎng)組，P<0.05)，與MSCs共培養(yǎng)后其凋亡率降低(17.47±1.62％，vsDMEM組，P<0.05)，而與AP-MSCs共培養(yǎng)后其凋亡率進(jìn)一步降低(11.01μ2.10％，vsDMEM組和MSCs組，P<0.05)。 3.MSCs和AP-MSCs對(duì)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響MSCs特別是AP-MSC

9、s提高了bcl-2/bax的比值，減少了缺氧再?gòu)?fù)氧后的心肌細(xì)胞的caspase-3的激活。 4.MSCs的移植后的體內(nèi)追蹤細(xì)胞移植后4周，在SD大鼠心肌內(nèi)可見DAPI標(biāo)記的MSCs或AP-MSCs，表明心肌注射成功，并有MSCs在心肌內(nèi)定植。 5.MSCs特別是AP-MSCs減少了心梗后的心肌細(xì)胞凋亡心梗后心肌細(xì)胞凋亡明顯增加(DMEM組：14.54±0.60％，vsSham組，P<0.05)，MSCs移植組凋亡減少(1

10、1.18±0.88％，vsDMEM組，P<0.05)，AP-MSCs移植組凋亡進(jìn)一步減少(9.03±0.42％，vsDMEM組和MSCs組，P<0.05)。Western-blot檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)MSCs移植特別是AP-MSCs移植提高了bcl-2/bax的比值，減少了心肌caspase-3的激活。 6.MSCs特別是AP-MSCs移植改善了心梗后大鼠的心功能心梗后大鼠心功能明顯下降(FS％20.94±1.20，vsSham47.64

11、±1.55，P<0.05)，MSCs移植后心功能增加(FS％37.12±2.00，vsDMEM，P<0.05)，AP-MSCs移植更為明顯(FS％43.32±1.82，vsMSCs，P<0.05). 7.MSCs特別是AP-MSCs移植減少心梗面積細(xì)胞移植后四周MSCs組心梗面積減少(38.76±1.42％，vs.DMEM組：47.30±2.63％，P<0.05)，而AP-MSCs組心梗面積進(jìn)一步減少(32.8±1.67％，vs

12、MSCs組，P<0.05)。 8.AP-MSCs移植增加了心梗后心肌的血管密度和VEGF的表達(dá)AP-MSCs移植組血管密度增加(6.10±0.23，vs.DMEM組.4.88±0.37和MSCs組：4.78±0.27，P<0.05)，并且VEGF表達(dá)增加。 結(jié)論： MSCs上調(diào)了缺氧后復(fù)氧的大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2/Bax比例并抑制caspase-3的激活，從而減輕了心肌細(xì)胞的凋亡。缺氧預(yù)處理增強(qiáng)了這種作用。