胸腺素β4對體外培養(yǎng)的正常人肝細(xì)胞增殖的影響及肝細(xì)胞癌患者血清胸腺素β4檢測.pdf

1、目的:1.探索胸腺素β4(Tβ4)對體外培養(yǎng)的正常人肝細(xì)胞(來自7702細(xì)胞系)是否具有促進(jìn)增殖的作用，并研究其可能的作用機(jī)制。2.通過檢測肝細(xì)胞癌患者血清Tβ4水平，研究不同影響因素對其血清Tβ4水平的影響。
　　方法:1.體外培養(yǎng)7702細(xì)胞，向處于對數(shù)生長期的細(xì)胞加入含有不同濃度Tβ4的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中Tβ4濃度分別為1ng/ml、100ng/ml、1μg/ml，相應(yīng)命名為1ng/ml組、100ng/ml組、1μg/ml組。

2、同時設(shè)立空白對照組，加入等量的不含Tβ4的培養(yǎng)液。于加入處理因素后12h、24h、48h、60h時間點，采用MTT方法檢測各組OD值并比較。于加入處理因素后的48h時間點，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測β-catenin、E-cadherin、肝細(xì)胞生長因子(HGF)的表達(dá)，采用Westernblot方法檢測Tβ4含量及β-catenin表達(dá)，采用RT-PCR方法檢測HGF、CyclinD1的表達(dá)。2.收集肝細(xì)胞癌(HCC)患者血清標(biāo)本，采用

3、ELISA方法檢測80例HCC患者血清Tβ4水平，并與40例健康人及30例肝硬化患者比較。同時比較不同腫瘤情況及肝功能對HCC組患者血清Tβ4濃度的影響。
　　結(jié)果:1.MTT法檢測細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Tβ4處理的7702細(xì)胞在各時間點測得的OD值均高于相應(yīng)時間點空白對照組測得的OD值，即加入外源性Tβ4可刺激細(xì)胞增殖，且Tβ4濃度越高，對細(xì)胞增殖的刺激作用越明顯(P<0.01)。2.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測發(fā)現(xiàn)，加入外源性Tβ4后，

4、細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)增加，且隨著Tβ4濃度增加，各組β-catenin染色的平均累積光密度(IOD)值升高，其中對照組分別與3個實驗組比較、1ng/ml組與1μg/ml組比較、100ng/ml組與1μg/ml組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，1ng/ml組與100ng/ml組比較，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.59)。而加入外源性Tβ4后，細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)降低，且隨著Tβ4濃度增加，各組E-cadheri

5、n染色的平均IOD值降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測各組細(xì)胞中HGF的表達(dá)，檢測不到陽性表達(dá)。3.Westernblot方法檢測細(xì)胞總蛋白中Tβ4、β-catenin含量發(fā)現(xiàn)，隨著加入外源性Tβ4濃度增加，各組細(xì)胞總蛋白中Tβ4、β-catenin含量增加。4.RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，加入外源性Tβ4后，CyclinD1的表達(dá)增加，以內(nèi)參GAPDH基因及空白對照組基因表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)，換算2-△△CT值得到，1

6、ng/ml組、100ng/ml組及1μg/ml組CyclinD1基因的2以-△△CT值分別為(7.097±2.576)、(12.960±0.971)及(55.131±26.290)，各組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。而HGF目的基因擴(kuò)增未能得到結(jié)果，即7702細(xì)胞中未見HGF表達(dá)。5.HCC患者[1.4972(1.0675-2.6932)μg/ml]及肝硬化患者[1.8112(0.8367-2.3184)μg/ml]血清Tβ4水平均低于健康人[

7、9.5306(5.2466-13.7666)μg/ml]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。而肝硬化組與HCC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。按照BCLC分期將HCC患者分為A期、B期、C期及D期4個亞組，血清Tβ4濃度分別為1.0446(0.8911-1.6242)μg/ml、1.6667(1.1492-2.65331μg/ml、2.1333(1.0425-3.1421)μg/ml及1.2748(1.1335-2.7301)μg/ml，差異

8、有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034)。按照CLIP分期將HCC患者分為0分、1分、2分、3分、4分、5分6個亞組，血清Tβ4濃度分別0.9841(0.8871-2.1787)μg/ml、1.5350(1.0821-2.6188)μg/ml、1.2783(1.0073-2.0041)μg/ml、2.7714(1.1805-3.1402)μg/ml、1.0627(0.9626-1.1814)μg/ml和2.0948(1.1582-4.0003)μ

9、g/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)。HCC組患者中有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組血清Tβ4濃度[1.5872(1.1251-2.7407)μg/ml]高于無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組[1.0632(0.9053-1.7015)μg/ml]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.024)；有門脈瘤栓組[2.4440(1.1424-3.1441)μg/ml]高于無門脈瘤栓組[1.1993(0.9991-1.9661)μg/ml]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.010)；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

10、組[2.0233(1.1451-3.1158)μg/ml]高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組[1.3971(1.0018-2.5284)μg/ml]，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.175)。無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移而且無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的HCC患者按照肝功能Child-pugh評分分為A級、B級、C級3組，血清Tβ4濃度分別為1.7228(1.0540-2.6878)μg/ml、1.3377(0.9934-1.8901)μg/ml及0.9820(0.7939-1.1842)

11、μg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039)。
　　結(jié)論:1.在體外培養(yǎng)的正常人肝細(xì)胞中，加入外源性Tβ4可刺激細(xì)胞增殖，且加入Tβ4濃度越高，刺激細(xì)胞增殖的作用越明顯。隨著加入外源性Tβ4濃度增加，細(xì)胞中β-catenin、CyclinD1表達(dá)增加，同時E-cadherin表達(dá)下降，未檢出細(xì)胞中有HGF表達(dá)。2.肝細(xì)胞癌患者血清Tβ4濃度低于健康人，且肝功能越差，血清Tβ4濃度越低。而發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移或門脈瘤栓的患者血清Tβ4濃度