C3d的免疫負(fù)調(diào)控作用及其可能的機(jī)制.pdf

1、為了證明三拷貝C3d的免疫負(fù)調(diào)控作用,該課題分別選擇hCGβ、HER-2/neu、HBV-preS2/S作為模式抗原,設(shè)計(jì)相應(yīng)的基因疫苗,通過(guò)基因免疫手段免疫小鼠以觀察C3d對(duì)特異性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用,并探討其可能的機(jī)制.第一部分C3d的免疫負(fù)調(diào)控現(xiàn)象在以前的研究中我們?cè)l(fā)現(xiàn)C3d抑制hCGβ誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答,為確證C3d對(duì)hCGβ免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控作用,我們進(jìn)行了該部分研究.采用酶切法獲得hCGβ鏈的編碼基因(513bp),定向克隆入

2、TR421和TR421-C3d3質(zhì)粒,獲得hCGβ的真核表達(dá)載體TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3重組質(zhì)粒.為觀察hCGβ基因疫苗在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),用脂質(zhì)體法將TR421、TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系-7721細(xì)胞.放射免疫法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清發(fā)現(xiàn):重組質(zhì)粒TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3可在真核細(xì)胞中表達(dá)hCGβ,而TR421-hCGβ-C3d3質(zhì)粒在真

3、核細(xì)胞中表達(dá)hCGβ的量明顯低于TR421-hCGβ組.在此研究基礎(chǔ)上我們探討了C3d對(duì)hCGβ基因疫苗誘生的特異性體液免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用.以100μg TR421、TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3免疫雌性BALB/c小鼠,ELISA法檢測(cè)血清抗-hCGβ-IgG抗體,結(jié)果顯示所有TR421-hCGβ質(zhì)?；蛎庖咝∈竽軌蛘T導(dǎo)高水平的抗-hCGβ-IgG特異性抗體,而TR421-hCGβ-C3d3質(zhì)粒免疫小鼠誘導(dǎo)的抗體

4、水平較低,兩組相比有顯著性差異(P<0.001),提示C3d可抑制hCGβ抗體應(yīng)答.為了排除我們所用的系統(tǒng)對(duì)C3d免疫負(fù)調(diào)控作用的影響,我們又選擇HBV-preS2/S作為模式抗原,分別構(gòu)建了TR421-preS2/S和TR421-preS2/S-C3d3.通過(guò)RT-PCR檢測(cè)HBV基因疫苗在真核細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示preS2/S-C3d3融合蛋白的表達(dá)比preS2/S的表達(dá)低.在此基礎(chǔ)上,我們以TR421、TR421-p

5、reS2/S和TR421-preS2/S-C3d3免疫BALB/c小鼠,ELISA法檢測(cè)血清抗-HBs-IgG抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TR421-preS2/S重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗-HBs-IgG,而TR421-preS2/S-C3d3重組質(zhì)粒誘導(dǎo)了更高水平的特異性抗-HBs-IgG,兩者相比有顯著性差異(P<0.05),提示C3d可顯著增強(qiáng)基因免疫誘導(dǎo)的HBV特異性體液免疫應(yīng)答.第二部分C3d免疫負(fù)調(diào)控作用的再確立鑒于hCGβ是一種癌

6、胚抗原,我們?cè)O(shè)想是否還存在C3d對(duì)其他癌胚抗原的負(fù)調(diào)控作用,因而我們選擇了另外一種癌胚抗原-HER-2/neu,進(jìn)行了該部分研究.通過(guò)酶切獲得HER-2/neu胞外區(qū)的編碼基因hECD,定向克隆入TR421和TR421-C3d3質(zhì)粒,獲得hECD的真核表達(dá)載體TR421-hECD及TR421-hECD-C3d3重組質(zhì)粒.通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)了TR421-hECD及TR421-hECD-C3d3在體內(nèi)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示TR421-hEC

7、D、TR421-hECD-C3d3在注射肌肉局部有顯色,而TR421注射肌肉局部無(wú)顯色,證實(shí)TR421-hECD及TR421-hECD-C3d3可在體內(nèi)有效表達(dá).在此基礎(chǔ)上探討了C3d對(duì)HER-2/neu基因疫苗誘生的特異性體液免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用.第三部分C3d免疫負(fù)調(diào)控作用的可能機(jī)制在前兩部分的研究中我們相繼證明了三拷貝C3d負(fù)調(diào)控基因免疫誘導(dǎo)的hCGβ、HER-2/neu特異性免疫應(yīng)答,但可以增強(qiáng)基因免疫誘導(dǎo)的HBV特異性免疫應(yīng)答,

8、分析可能的原因:一是抗原性的差異導(dǎo)致了C3d不同的調(diào)節(jié)作用;另一方面CD21-CD19在B細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體—抗原復(fù)合物的提呈過(guò)程中起著重要作用,C3d可能影響了B細(xì)胞對(duì)癌胚抗原的抗原提呈,從而導(dǎo)致了C3d的負(fù)調(diào)控;另外,IL-4在CD21增強(qiáng)B細(xì)胞活化中也起著重要作用.我們以hCGβ為模式抗原研究了C3d免疫負(fù)調(diào)控作用的可能機(jī)制.為了檢測(cè)C3d對(duì)B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)hCGβ抗原提呈的影響,我們分別用hCGβ、hCGβ-C3d3與B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞

9、共孵育,滅活,然后與不同質(zhì)粒免疫小鼠脾細(xì)胞按一定效靶比共孵育,檢測(cè)CPM值發(fā)現(xiàn):巨噬細(xì)胞對(duì)hCGβ和hCGβ-C3d3的提呈,在TR421-hCGβ、TR421-hCGβ-C3d3重組質(zhì)粒免疫小鼠脾細(xì)胞,SI沒(méi)有明顯差異(P>0.05),提示C3d不影響巨噬細(xì)胞對(duì)hCGβ的提呈;至于B淋巴細(xì)胞對(duì)hCGβ和hCGβ-C3d3的提呈,TR421-hCGβ-C3d3免疫組的SI都顯著低于TR421-hCGβ(P<0.05),提示C3d負(fù)調(diào)控了