狂犬病病毒基因工程疫苗制備及基因治療載體的改造.pdf

1、狂犬病毒是由彈狀病毒科狂犬病毒屬的成員，它是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組主要編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，從3'端到5'端依次為核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和依賴RNA的RNA多聚酶(L)。其中，G蛋白不僅是唯一可以誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)產(chǎn)生中和抗體的抗原蛋白，還決定病毒的細(xì)胞嗜性和病毒吸附細(xì)胞的能力，從而使狂犬病毒具有強(qiáng)烈的神經(jīng)嗜性。
　　狂犬病是狂犬病毒引起的一種人畜共患、急性、致死性的傳染病，機(jī)體一旦感染發(fā)

2、病，死亡率100％。目前，尚無(wú)有效的治療方式，暴露前疫苗免疫是最好的預(yù)防措施。同時(shí)，由于狂犬病毒G蛋白在體外難以表達(dá)純化，所以G蛋白多克隆抗體和單克隆抗體難以制備。
　　基于以上背景，本課題主要從以下3個(gè)方面進(jìn)行:
　　1.狂犬病毒亞單位疫苗的制備
　　根據(jù)G蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的特點(diǎn)，使用具有安全性高，免疫原性低、表達(dá)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)的腺相關(guān)病毒表達(dá)載體AAV病毒載體表達(dá)G蛋白，制備一種新型的亞單位疫苗。本課

3、題選取了狂犬病毒疫苗株SADL16的G蛋白（包括第194、333位氨基酸突變和未突變類型）、、B2C株G蛋白及N2C株G蛋白作為表達(dá)對(duì)象。同時(shí)我們?cè)诒磉_(dá)載體中插入土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)以提高G蛋白表達(dá)量。質(zhì)粒構(gòu)建完成后在HEK-293T細(xì)胞系上包裝成能表達(dá)G蛋白的亞單位疫苗，經(jīng)過(guò)滴度測(cè)定、G蛋白表達(dá)檢測(cè)后，通過(guò)肌肉注射免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，然后分別在免疫后第1、2、3、9月末檢測(cè)小鼠體內(nèi)中和抗體水平。結(jié)果表明

4、，免疫組小鼠產(chǎn)生較高水平的中和抗體，且比疫苗對(duì)照組存在明顯的優(yōu)勢(shì)。為了檢測(cè)抗體是否可以在狂犬病毒感染后產(chǎn)生保護(hù)力，以50倍的狂犬病毒CVS-24株半數(shù)致死劑量進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)。攻毒實(shí)驗(yàn)表明，該表達(dá)G蛋白的AAV亞單位疫苗可以為機(jī)體提供有效的保護(hù)力。與其他疫苗相比，該疫苗具有成本低、免疫程序簡(jiǎn)單（只需一次免疫即可）、貯存和運(yùn)輸條件要求低(4℃)以及抗體水平持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
　　2.G蛋白多克隆抗體的快速制備
　　由于G蛋白在

5、體外難以表達(dá)純化，可以利用表達(dá)G蛋白的AAV重組病毒免疫小鼠，然后收集其血清作為G蛋白的多克隆抗體。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，可以利用此方法快速制備G蛋白的多克隆抗體。
　　3.狂犬病毒作為基因治療載體的改造
　　由于狂犬病毒具有嚴(yán)格的嗜神經(jīng)性，我們嘗試逐步改造狂犬病毒，提高其安全性，并最終作為神經(jīng)退行性疾病基因治療的轉(zhuǎn)移載體使用。首先，我們將BDNF、NGF插入缺失G蛋白的狂犬病毒基因組，然后在此基礎(chǔ)上再缺失狂犬病毒M蛋

6、白和P蛋白。目前，狂犬病毒G蛋白缺失株已經(jīng)在B7GG細(xì)胞系拯救完成，后者由于沒(méi)有對(duì)應(yīng)的細(xì)胞系可以完成病毒的拯救，所以我們利用CRISPR技術(shù)在B7GG細(xì)胞系基礎(chǔ)上構(gòu)建同時(shí)表達(dá)M、P、G蛋白的細(xì)胞系。同時(shí)，本課題以AAV重組病毒過(guò)表達(dá)α-突觸核蛋白構(gòu)建帕金森綜合征(Parkinson's disease，PD)疾病模型，目前已完成了前期的質(zhì)粒構(gòu)建及病毒包裝工作。
　　目前沒(méi)有細(xì)胞系可以用于缺失M、P蛋白的狂犬病毒的拯救，所以我們B7