髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1天然配體的初步研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是指微生物入侵機(jī)體感染后所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱或體溫下降、白細(xì)胞增多或減少、心動過速、呼吸急促等癥狀，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致嚴(yán)重膿毒癥(severe sepsis)、膿毒性休克(septic shock)甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)。膿毒癥的病理生理機(jī)制比較復(fù)雜，目前認(rèn)為是由于機(jī)體免疫系統(tǒng)對侵入病原

2、體的過度的炎癥反應(yīng)和凝血反應(yīng)等導(dǎo)致機(jī)體組織器官損害，并引起循環(huán)紊亂及其他一系列的損害。其分子機(jī)制目前認(rèn)為是感染后炎癥細(xì)胞活化產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子，而這些促炎細(xì)胞因子又可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞激活，兩者互為因果形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)并逐級放大，最終全身播散引起膿毒癥。
　　 髓系細(xì)胞觸發(fā)受體 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells，TREM)-1是由Bouchon等在2000年發(fā)現(xiàn)的一種跨膜

3、受體蛋白，為免疫球蛋白超家族成員，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面。膿毒癥時TREM-1表達(dá)明顯上調(diào)，而相關(guān)研究也表明作為膿毒癥炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵分子，TREM-1在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。TREM-1作用主要通過與其天然配體結(jié)合后激活TREM-1/DAP12信號通路，進(jìn)而增強(qiáng)炎癥因子釋放、炎癥細(xì)胞浸潤和增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的致炎作用。由于TREM-1信號通路在膿毒癥中有重要作用，目前TREM-1的天然配體尚不明，配體研究有助于闡明TR

4、EM-1分子通路機(jī)制，能為診治膿毒癥提出有效的分子診治策略。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者送檢標(biāo)本中金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌為常見的病原菌；而熱失活的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌孵育處理單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞后TREM-1和相應(yīng)炎癥因子如TNF-α、IL-1β的表達(dá)均明顯上調(diào)，提示TREM-1配體可能存在這些細(xì)菌上。
　　 目的：本實驗通過測定人中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞經(jīng)熱失活的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌三種細(xì)菌的菌體、

5、細(xì)胞壁和細(xì)胞壁組分進(jìn)行處理后細(xì)胞TREM-1 mRNA水平變化和細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β濃度變化，研究各處理方法對TREM-1信號通路影響，進(jìn)而確定TREM-1天然配體可能性質(zhì)。
　　 方法：取健康志愿者外周靜脈血，密度梯度離心法分離人外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞并進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；高滲透壓誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞壁缺陷的金黃色葡萄球菌L型和銅綠假單胞菌L型。離心對數(shù)期標(biāo)準(zhǔn)菌、金

6、黃色葡萄球菌L型和銅綠假單胞菌L型獲得菌體，經(jīng)熱滅活后分別將100μl濃度為1×109/ml金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌L型及銅綠假單胞菌L型加入中性粒細(xì)胞懸液和單核細(xì)胞懸液，置37℃，5％ CO2條件細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。玻璃珠破碎法破碎菌體，超聲提取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁，分別加入上述三種細(xì)胞壁于原代培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞懸液和單核細(xì)胞懸液，置37℃，5％CO2條件細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24

7、h。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取細(xì)胞壁多糖，氯仿-甲醇法提取脂類，硫酸銨鹽析法提取細(xì)胞壁蛋白，加入三種細(xì)菌細(xì)胞壁組分于原代培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞懸液和單核細(xì)胞懸液，置37℃，5％CO2條件培養(yǎng)24h。取孵育后各處理組中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并以GAPDH為內(nèi)參基因，熒光定量PCR檢測TREM-1 mRNA水平，ELISA雙抗體夾心法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β濃度。
　　 結(jié)果：1.中性

8、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞經(jīng)金黃色葡萄球菌菌體、銅綠假單胞菌菌體、金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁和銅綠假單胞菌細(xì)胞壁處理后TREM-1 mRNA水平上調(diào)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β濃度明顯升高（P<0.05）；能與配體競爭性結(jié)合的LP17可以削弱此效應(yīng)（P<0.05）。中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞經(jīng)結(jié)核分枝桿菌菌體、結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁和結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁成分處理后TREM-1 mRNA水平、細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β濃度與空白對照無明顯差異（P

9、>0.05）。
　　 2.中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞經(jīng)細(xì)菌細(xì)胞壁成分處理后，與空白組相比，金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁多糖處理后中性粒細(xì)胞TREM-1 mRNA水平上調(diào)3.86±0.20倍，單核細(xì)胞TREM-1 mRNA水平上調(diào)5.15±0.56倍（P<0.05）；銅綠假單胞菌細(xì)胞壁多糖處理后中性粒細(xì)胞TREM-1 mRNA水平上調(diào)4.03±0.15倍，單核細(xì)胞TREM-1 mRNA水平上調(diào)7.22±0.73倍（P<0.05），細(xì)胞培養(yǎng)上清中

10、TNF-α和IL-1β濃度明顯升高，能競爭性結(jié)合配體的LP17可以削弱此效應(yīng)（P<0.05）。中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分別經(jīng)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白、金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁脂類、銅綠假單胞菌蛋白、銅綠假單胞菌脂類、結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁蛋白、結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁脂類和結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁多糖處理后TREM-1 mRNA水平、細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β濃度與空白組相比均無明顯變化（P>0.05）。
　　 3.中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞經(jīng)上述