豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子遺傳變異與疫苗研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)俗稱“豬藍耳病”,是目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一,在臨床上以造成懷孕母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎以及仔豬的呼吸系統(tǒng)癥狀為主要特征。本文從PRRS的血清學調(diào)查、分子遺傳變異、滅活疫苗研制、混合感染和PRRSV傳染性oDNA克隆等方面進行了研究和探討。 1、PRRS血清學調(diào)查與病毒分離鑒定 為了調(diào)查山東

2、地區(qū)PRRS的感染狀況,2004年至2006年從山東各地未免疫PRRS疫苗的豬場采集1,332份血樣,采用IDEXX公司的間接ELISA試劑盒進行檢測。結果表明,59.5％的血清樣品呈PRRS抗體陽性,其中偏遠農(nóng)村的散養(yǎng)豬場和小規(guī)模豬場只有32.5％的血清樣品呈PRRS陽性,然而,從大型規(guī)?；i場采集的血清樣品中PRRS抗體的陽性比例占83.1％。從PRRS陽性的豬場樣品中分離到豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),在Marc-145細

3、胞上呈現(xiàn)典型的細胞病變(CPE),但不同PRRSV分離株產(chǎn)生CPE的時間與類型不盡相同,并且不同分離株的毒力也存在較大差異。本研究結果表明,PRRS的流行狀況與豬場規(guī)模大小和豬群密度密切相關,并且本地區(qū)豬場中存在不同表型的PRRSV分離株。 2、PRRSV山東分離株分子遺傳變異研究 設計了4對PRRSV特異性引物,分別擴增5個PRRSV山東分離株的ORF5基因、ORF6基因、ORF7基因和Nsp2基因,并克隆至pMD18

4、-T載體,送至公司測序,采用分子生物學軟件分析病毒的分子遺傳變異規(guī)律。序列分析表明,5個分離株ORF5基因的核苷酸序列同源性為88.2％-99.2％,ORF6基因的同源性為94.9％-99.8％,ORF7基因的同源性為93.5％-100％。其中兩株PRRSV傳統(tǒng)毒株與北美型代表株VR2332的核苷酸序列高度同源,而3株PRRSV變異株Nsp2蛋白缺失30個氨基酸,與國內(nèi)以前報道的變異株JXA1株高度同源,與VR-2332株同源性相差較大

5、。研究結果表明,山東省豬場近幾年同時存在PRRSV傳統(tǒng)毒株和變異株感染,并且近年來,山東PRRSV流行毒株有從傳統(tǒng)美洲型向Nsp2基因缺失變異株演化的趨勢。 3、PRRS滅活疫苗(SD1株)研究 在對PRRSV SD1株細胞生物學培養(yǎng)特性研究的基礎上,我們對PRRS滅活疫苗生產(chǎn)工藝進行了研究,包括毒種繁殖、滅活方法、乳化工藝、安全檢驗與效力檢驗等內(nèi)容。將效價大于107.0TCID50/mL的PRRSV-SD1株病毒培養(yǎng)液

6、用終濃度為0.1％的甲醛于37℃滅活20 h,加入4％吐溫-80作為水相,與油相(按油水比2:1的比例)于膠體磨中乳化而成。疫苗性狀為油包水型,無菌檢驗合格,無毒副作用及其他不良反應。效力試驗結果顯示,當血清中和抗體效價≥1:10時,豬攻毒后表現(xiàn)基本正常,無不良反應。疫苗的免疫有效期可達6個月,4℃保存期暫定為12個月。田間試驗和區(qū)域試驗表明,母豬免疫后弱仔率、木乃伊胎率、死胎率下降約8％,仔豬成活率升高約10％,免疫豬群的中和抗體陽性

7、率(≥1:10)可達80％以上。 4、從PRRS疑似病料中檢測PCV2的研究 2005年至2007年期間從山東各地共收集156份PRRS疑似病料(組織和血清),其中102份經(jīng)RT-PCR確定為PRRSV陽性。設計特異性引物,采用PCR技術,從PRRS疑似病料中檢測豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)。結果顯示,有46份(29.5％)組織病料勻漿(肺、肝、脾、腎和淋巴結)為PCV2型陽性,然而,只有32份血清(20.5％)為PCV2

8、陽性。其中,PRRS陽性病料中PCV2的陽性率為33.3％(34/102),而PRRS陰性病料中PCV2的陽性率僅為22.2％(12/54)。根據(jù)PCV2開放閱讀框2(ORF2)繪制的遺傳進化樹分析表明,本研究中分離的PCV2核苷酸序列同源性在98.3％-100％之間,與國內(nèi)外其他分離株相比,本地分離株更接近于法國分離株。研究結果表明,本地區(qū)PRRS疑似病料中PCV2的陽性率較高,而且其感染率在PRRS陽性病料和陰性病料中有著明顯差異(

9、P<0.05)。 5、應用PRRSV傳染性cDNA克隆構建PRRSV-PCV2重組病毒的研究 PRRSV傳染性cDNA克隆的研制成功使我們能夠運用反向遺傳學技術對病毒的基因組進行操作,在體外轉染細胞,產(chǎn)生帶有新的遺傳標記的PRRSV。在本研究中,我們對運用PRRSV傳染性cDNA克隆表達外源基因進行了探討和嘗試。因為PCV2是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要致病因子之一,而核衣殼蛋白基因(Capsid prot

10、ein gene,即ORF2 gene)是PCV2的主要結構基因,其編碼的核衣殼蛋白起具有重要免疫原性。在本研究中,我們首先采用PCR擴增出PCV2 ORF2基因,然后通過克隆技術插入PRRSV傳染性cDNA分子克隆,轉染細胞產(chǎn)生PRRSV-PCV2重組病毒。運用RT-PCR技術和免疫熒光技術在重組病毒感染的細胞中成功驗證了PCV2核衣殼蛋白的表達。為了進一步評估PRRSV-PCV2重組病毒的免疫原性,分別用PRRSV原始野毒和PRRS

11、V-PCV2重組病毒各接種5頭仔豬,另外一組接種Marc-145細胞培養(yǎng)液作為對照組。試驗仔豬于第0d和第21d接種兩次,頸部肌肉注射,然后分別于接種后4、7、14、21、28和35d各采血一次,檢測PRRSV病毒血癥持續(xù)時間和PRRSV、PCV2抗體水平。結果顯示,PCV2抗體在接種后21d開始轉陽,至少維持到接種后35d。與PRRSV原始野毒相比,PRRSV-PCV2重組病毒引起的病毒血癥明顯縮短。試驗結果表明,PRRSV能夠作為載