弓形蟲(chóng)基因疫苗SAG1-MIC4免疫小鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、弓形蟲(chóng)是一種全球分布且廣泛寄生于人體及動(dòng)物有核細(xì)胞的專性寄生原蟲(chóng)，能引起人獸共患的弓形蟲(chóng)病。該病的人群感染極為普遍，多數(shù)屬于隱性感染。孕婦孕期首次感染弓形蟲(chóng)后可導(dǎo)致早產(chǎn)、流產(chǎn)、胎兒發(fā)育畸形。弓形蟲(chóng)病也是一種常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性寄生蟲(chóng)病，是導(dǎo)致免疫功能嚴(yán)重低下的患者如患有惡性腫瘤、施行器官移植、長(zhǎng)期接受放射治療、應(yīng)用免疫抑制劑以及先天性、后天性免疫缺陷者如艾滋病患者死亡的一種重要原因。此外，由弓形蟲(chóng)引起的禽畜類疾病也給畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

2、迄今尚無(wú)治療弓形蟲(chóng)病的特效藥物，因此研制安全有效的疫苗極為迫切。 弓形蟲(chóng)生活史較復(fù)雜，抗原成分具有發(fā)育階段的特異性或差異性。因此成功的弓形蟲(chóng)疫苗應(yīng)針對(duì)多個(gè)特異性抗原，所產(chǎn)生的保護(hù)性免疫力需要針對(duì)生活史中一個(gè)以上的感染階段。SAG1為弓形蟲(chóng)速殖子期特異的主要表面抗原之一，具有高度的免疫原性和免疫保護(hù)性，是弓形蟲(chóng)疫苗開(kāi)發(fā)的主要抗原。MIC4是弓形蟲(chóng)微線體分泌的一種蛋白，主要協(xié)助蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞，在弓形蟲(chóng)生活史的所有感染階段中均有表達(dá)

3、，具有高度的保守性和免疫原性。SAG1和MIC4在蟲(chóng)體入侵宿主的過(guò)程中相互促進(jìn)，其相應(yīng)的抗體可有效拮抗弓形蟲(chóng)感染。 同時(shí)，為攻克核酸疫苗免疫效力低下的難題，我們選用霍亂毒素（Choleratoxin）A2/B亞單位（CTA2/B）的真核表達(dá)質(zhì)粒作為基因佐劑，以增強(qiáng)弓形蟲(chóng)復(fù)合抗原基因SAG1—MIC4的免疫效果?；魜y毒素是目前常用的免疫佐劑，具有較強(qiáng)的粘膜免疫原性和粘膜免疫佐劑效應(yīng)，能有效增強(qiáng)抗原蛋白的免疫原性，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體的免疫

4、作用。CTA2/B是一種有效誘導(dǎo)Th2型（IgG，sIgA）細(xì)胞反應(yīng)為主的免疫佐劑，是粘膜免疫的有效激活劑，故可增強(qiáng)DNA疫苗粘膜免疫的免疫效果。 本研究首先利用PCR技術(shù)從弓形蟲(chóng)基因組中獲取基因SAG1和MIC4以構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1—SAG1，pcDNA3．1—MIC4及復(fù)合質(zhì)粒pcDNA3．1—SAG1—MIC4。通過(guò)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，利用RT—PCR檢測(cè)其正常轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況。最后利用構(gòu)建好的質(zhì)粒及佐劑pcDN

5、A3．1—CTA2/B通過(guò)粘膜免疫的方式免疫小鼠，檢測(cè)這些疫苗引起的體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo)。之后腹腔注射弓形蟲(chóng)速殖子以觀察并研究其免疫保護(hù)性。結(jié)果正確的構(gòu)建了三種表達(dá)載體，經(jīng)RT—PCR證明各質(zhì)粒在Hela細(xì)胞中得到正確的轉(zhuǎn)錄。檢測(cè)的免疫指標(biāo)證明這些質(zhì)粒均能引起很好的免疫應(yīng)答反應(yīng)。弓形蟲(chóng)RH株攻擊試驗(yàn)表明各疫苗對(duì)小鼠均有一定免疫保護(hù)性，且復(fù)合基因疫苗的免疫效果明顯優(yōu)于單基因疫苗，并且基因佐劑CTA2/B可以對(duì)該復(fù)合基因疫苗起到很好的免疫