玉米貝殼杉烯合酶功能鑒定及kauralexins關鍵酶基因An2啟動子分析.pdf

1、玉米(Zea mays L.)是重要糧食作物，但病蟲害導致其產量和品質下降，威脅糧食安全。植保素是植物受病害真菌侵染產生的小分子次生代謝化合物。Kauralexins是玉米中首次發(fā)現的一種二萜植保素，具有良好的抗病原真菌活性，且對玉米螟幼蟲有拒食作用。Kauralexin具有（異）貝殼杉烯骨架，其生物合成途徑是由柯巴基焦磷酸合酶CPS和（異）貝殼杉烯合酶KS(L)連續(xù)催化前體GGPP形成貝殼杉烯或異貝殼杉烯，進一步由細胞色素P450氧化

2、酶氧化修飾形成。參與kauralexin生物合成的CPS已經被鑒定為An2，但其貝殼杉烯合酶還未鑒定。另外植物激素赤霉素的生物合成也需要貝殼杉烯合酶的參與，有報道稱玉米矮化突變體d5是由于貝殼杉烯合酶基因突變導致赤霉素合成受阻而產生的矮化，但相關基因還未被鑒定。并且到目前為止，還未有報道鑒定玉米貝殼杉烯合酶基因，這限制了玉米植保素kauralexin的相關研究及其應用。同時，植保素積累與其代謝關鍵基因表達密切相關，分析kauralexi

3、n代謝關鍵基因An2的啟動子活性并鑒定其順式元件，能為kauralexin的代謝調控研究奠定基礎。
　　本研究首先在玉米全基因組中搜索貝殼杉烯合酶，并通過系統(tǒng)進化對其進行功能預測。其中ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1與禾本科植物的貝殼杉烯合酶具有較近的進化關系，即作為候選基因進行功能研究。通過大腸桿菌重組表達和代謝工程分析，并結合本氏煙瞬時表達，對產物進行GC-MS檢測確定其生化功能，即催化ent-CPP形成貝殼杉烯。進一

4、步通過亞細胞定位分析確認其功能。同時分析了這三個基因在病原菌侵染和激素處理下的表達模式，并結合玉米d5矮化突變體確定了這三個基因的生物學功能。另外，還利用基因槍瞬時表達體系，分析了An2基因啟動子的活性區(qū)域。主要結果如下:
　　1.對從玉米基因組中搜索出的貝殼杉烯合酶基因，通過氨基酸序列比對，與其他禾本科植物的KS(L)s等進行系統(tǒng)進化分析，發(fā)現ZmKSL3與多種植物中參與赤霉素合成的KS的親緣關系十分相近，而ZmKSL5與ZmT

5、PS1除了本身相近之外，還與小麥中的TaKSL5-1/2相近，它們都不含有γ結構域。進一步分析發(fā)現ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1在玉米二號染色體上呈現串聯排列，預示著這三個基因在進化上可能是串聯復制而來。
　　2.在大腸桿菌重組表達這三個基因并通過代謝工程的方法與玉米中的ent-CPP合酶An2共表達，GC-MS檢測產物發(fā)現ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1都能催化ent-CPP生成貝殼杉烯(ent-kaurene

6、)。前人研究認為ZmTPS1為倍半萜合酶，本研究通過分析發(fā)現ZmTPS1確實具有一定的倍半萜合酶活性，能催化FPP產生一系列倍半萜，而ZmKSL3和ZmKSL5則不具有該功能。但進一步在本氏煙草中瞬時表達這三個基因，結果證明它們在植物體內也能產生貝殼杉烯。亞細胞定位分析顯示，這三個蛋白都定位與質體中，符合其貝殼杉烯合酶的功能。因此結合生物化功能鑒定和亞細胞定位分析確定這三個基因均編碼貝殼杉烯合酶。
　　3.對玉米d5突變體進行半定

7、量PCR分析發(fā)現這三個基因中只有ZmKSL3在d5突變體中不表達，并且以往轉錄組數據顯示其在生長旺盛的區(qū)域有高表達，表明ZmKSL3參與赤霉素生物合成。而對該突變體中ZmKSL3基因組序列分析，發(fā)現與其野生型母本和B73自交系中的序列相比，突變體中的ZmKSL3在5'-UTR部分起始密碼子之前缺失了100bp的片段，其中包含與轉錄相關的CAAT元件，這可能就是引起其不表達的原因。而ZmTPS1或ZmKSL5的突變體均并未出現矮化的表現型

8、，表明不參與赤霉素生物合成。前人研究發(fā)現d5突變體中仍然可檢測到少量的貝殼杉烯，對d5突變體中ZmKSL5和ZmTPS1序列進行分析未發(fā)現明顯突變，進一步進行體外生化功能分析發(fā)現這兩個基因的d5克隆仍然具有貝殼杉烯合酶功能，但可能具有嚴格的調控機制使其不能對d5突變進行補償。
　　4.利用熒光定量PCR，分析了ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1在不同處理下的表達情況，并與kauralexin代謝關鍵基因An2進行比較。研究表

9、明，ZmKSL3在禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)孢子侵染的葉片和ABA處理的根部有少量誘導，這可能與其啟動子中所含有的相關元件有關。而ZmKSL5和ZmTPS1在禾谷鐮刀菌孢子侵染的葉片、ABA處理的地下部分、MeJA和ETH聯合處理的葉片和MeJA單獨處理的葉片中都明顯上調，并且與An2在這四種處理中的表現呈現正相關。對玉米生長發(fā)育各時期的轉錄組數據分析發(fā)現ZmTPS1和ZmKSL5與An2之間也有相似的表達模

10、式，而ZmKSL3則不同，這表明ZmTPS1與ZmKSL5參與植保素kauralexin的合成。
　　5.通過在線預測發(fā)現An2啟動子中含有2個W-box，可能與其參與植保素kauralexin的誘導表達有關。利用基因槍轟擊介導的瞬時轉化體系，在玉米愈傷組織中進行了An2基因啟動子活性的分析，結果發(fā)現，不含有第一個W-box元件的啟動子片段A2F2與突變掉第一個W-box元件的A2F1M都無法檢測的啟動子活性，而含有第一個元件的A

11、2F1則能檢測到活性。這證明能夠介導An2啟動子的關鍵順式元件為其遠離起始密碼子的第一個W-box元件，這為研究kaurlexins代謝調控機制提供了基礎。
　　結論:本研究鑒定了三個玉米貝殼杉烯合酶基因，其中一個參與赤霉素生物合成，為玉米矮化突變體d5的突變基因，而另外兩個能夠被病原菌侵染和激素處理所誘導，可能參與植保素kauralexin生物合成，同時這三個基因在染色體上形成串聯排列，應起源為基因復制，之后發(fā)生功能異化。對ka