結(jié)核分支桿菌宿主體內(nèi)及體外生長必需基因的研究.pdf

1、背景：有效治療結(jié)核病必須廣泛深入地理解結(jié)核病的發(fā)病機制，確認結(jié)核分支桿菌(MTB)存活必需的分子物質(zhì)，通過阻斷該分子靶向可抑制MTB的生存。
　　 目的：以發(fā)現(xiàn)MTB在感染宿主及結(jié)核病病程各階段生存的必需基因為目的，建立了定義的MTB突變株庫。通過測試突變株在宿主體內(nèi)和體外應(yīng)激狀態(tài)下的生存能力，鑒別認識對MTB適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境并生長有重要意義的基因及發(fā)生機制。
　　 方法：以MTB野生臨床菌株CDC1551為母體，運用轉(zhuǎn)

2、移因子插入法建立鑒定MTB突變株庫。制備突變株混合液，感染小鼠、豚鼠及鼠肺巨噬細胞，并將混合液暴露于0.01％十二烷基硫酸鈉，5mM二酰胺，10 mM枸櫞酸和5％乙醇，應(yīng)用定義突變株分析設(shè)計隊列法(Designer Arrays forDefined Mutant Analysis，DeADMAn)及基因芯片技術(shù)和實時PCR技術(shù)，篩選在小鼠肺、豚鼠肺、活化巨噬細胞內(nèi)及各種化學(xué)刺激下存活能力顯著降低的突變株，這些突變株涉及的基因是MTB在

3、應(yīng)激狀態(tài)下生存的必需基因。
　　 結(jié)果：鑒定得到轉(zhuǎn)移因子單一突變位點的突變株481株，涉及349個開放閱讀框的387個位點。對涉及11個結(jié)核分支桿菌基因功能分類的186個獨立基因的突變株進行研究。共發(fā)現(xiàn)MTB在小鼠及豚鼠肺內(nèi)、肺泡巨噬細胞或化學(xué)刺激下生存的必需基因43個，其中近40％(17/43)參與脂代謝、中間代謝和呼吸功能，17％(7/43)參與細胞壁代謝。進一步的比較分析為認識基因功能提供了有力線索，為深入細致的關(guān)鍵基因產(chǎn)