玉米大斑病菌交配型基因片段的克隆與分析.pdf

1、玉米大斑病是發(fā)生在玉米上的一種重要病害，嚴(yán)重流行的年份會(huì)造成感病品種的大幅度減產(chǎn)。玉米大斑病原菌的有性態(tài)為Setosphaeria turcica，稱(chēng)玉米大斑剛毛座腔菌，屬于異宗配合子囊菌。菌株在有性繁殖階段分為兩個(gè)相反的交配型，即A交配型和α交配型。傳統(tǒng)鑒定交配型的方法為對(duì)峙培養(yǎng)法，需要的時(shí)間長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大，因此需要建立一種更為方便有效的分子生物學(xué)方法。 本研究以玉米大斑病菌菌株40(交配型為A)、01-23(交配型為α)、0

2、3-08(交配型為Aa)為材料。利用CTAB方法提取了病菌的基因組DNA，根據(jù)已公開(kāi)發(fā)表的子囊菌交配型基因MAT1-1和MAT1-2的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，從菌株01-23中擴(kuò)增得到了一個(gè)長(zhǎng)度為800bp左右的片段。對(duì)該片段進(jìn)行了回收，與pMD-19T simple vector連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，利用M13引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)插入片段的大小。利用ABI PRISM3730測(cè)序儀，對(duì)含有目的DNA片

3、段的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果去除載體后，長(zhǎng)度為859bp。生物信息學(xué)分析表明，該片段的編碼產(chǎn)物包含有一個(gè)α結(jié)構(gòu)域，屬于DNA結(jié)合蛋白家族。從菌株40中擴(kuò)增得到了一個(gè)長(zhǎng)度為250bp左右的片段，用同樣方法進(jìn)行了回收和測(cè)序，長(zhǎng)度為238bp。生物信息學(xué)分析表明，該片段的編碼產(chǎn)物包含有一個(gè)HMG-BOX結(jié)構(gòu)域，也屬于DNA結(jié)合蛋白家族。根據(jù)測(cè)序得到的核苷酸序列，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增交配型基因片段的特異引物；通過(guò)多次試驗(yàn)，確定了最佳的PCR反應(yīng)條件。對(duì)部分

4、已知交配型的菌株進(jìn)行的擴(kuò)增結(jié)果表明，不同交配型的菌株分別含有不同的交配型基因片段，從而建立了鑒定菌株交配型的分子生物學(xué)方法。該方法比傳統(tǒng)的對(duì)峙培養(yǎng)方法更為準(zhǔn)確，并且節(jié)省了時(shí)間，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度。 對(duì)兩性菌株03-08進(jìn)行了有性態(tài)誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)自交能夠產(chǎn)生子囊殼，表明該菌株具有自交親和性。對(duì)03-08的基因組DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，得到了交配型基因MAT1-1和MAT1-2的片段，表明兩性菌株的形成具有遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，從一定程度上支持了真菌的同