糖皮質(zhì)激素受體α亞型M565R、C638S、L753F、A573Q、GR2439insA定點(diǎn)誘變體的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoidreceptor，GR)突變和庫興綜合癥(CushingSyndrome)及各種自身免疫疾病有關(guān)。GR的配基(glucocorticoid，GC)，包括地塞米松、強(qiáng)地松等糖皮質(zhì)量激素被廣泛用于哮喘、過敏性鼻炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和白血病的治療。然而臨床使用皮質(zhì)類固醇激素由于糖皮質(zhì)激素抵抗的問題受到了很大的限制。GR是核受體家族中的重要成員，其也是一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，GR與糖皮質(zhì)激素的生物學(xué)效

2、應(yīng)需要由GR介導(dǎo)，GR與GC相作用才能發(fā)揮作用。GR基因結(jié)構(gòu)的發(fā)生點(diǎn)突變或者堿基插入或者缺失都會使GR的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變而導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素抵抗。關(guān)于糖皮質(zhì)激素抵抗的機(jī)制已研究多年，但未最終解決。大量的研究結(jié)果表明GR的基因結(jié)構(gòu)異常而導(dǎo)致的GR氨基酸改變是導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素抵抗的常見原因之一。對兩個(gè)家族性糖皮質(zhì)激素抵抗的研究發(fā)現(xiàn)，在與GC結(jié)合的激素結(jié)合區(qū)的點(diǎn)突變使GR與GC之間的親和力降低而造成糖皮質(zhì)激素抵抗。 我們以前的研究結(jié)果表明

3、GR的2349的基因位點(diǎn)有一腺嘌呤核苷酸插入而導(dǎo)致GR多合成20個(gè)氨基酸可能和狼瘡性腎炎的發(fā)病有關(guān)[3]。由于大量研究表明糖皮質(zhì)激素受體的基因改變是導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素抵抗的重要原因，我們擬從GR基因突變的與糖皮質(zhì)激素抵抗之間的關(guān)系進(jìn)行研究。我們在PRSHGRα質(zhì)粒的基礎(chǔ)上用定點(diǎn)誘變的方法構(gòu)建了糖皮質(zhì)激素受體α亞型的M565R、C638S、L753F、A573Q、GR2439insA五個(gè)誘變體，用野生型GR及M565R、C638S、L753F

4、、A573Q、GR2439insA五個(gè)誘變體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，用RT-PCR及Westernblot的方法檢測COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的受體表達(dá)情況，用野生型GR及各誘變體基因與報(bào)告基因PMMTV-CAT及PCH110質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后測定氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的表達(dá)情況以評估各誘變體的轉(zhuǎn)錄功能改變。用野生型GR及各誘變體基因轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，加入LPS刺激COS-7細(xì)胞，造成COS-7細(xì)胞的炎癥狀態(tài)，然后加入地塞米松

5、作用于COS-7細(xì)胞，測定轉(zhuǎn)染后COS-7細(xì)胞在地塞米松作用下的TGF-β1的表達(dá)抑制率以比較野生型GR及各GR誘變體的抗炎功能。 研究目的：用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將編碼糖皮質(zhì)激素受體α亞型的WtGR、M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入COS-7細(xì)胞，用RT-PCR及Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后的GR表達(dá)情況，然后檢測各誘變體在COS-7細(xì)胞中表達(dá)后與野生型GR相比較所發(fā)生的功能改變。

6、 研究方法：1.我們用Quickchange定點(diǎn)誘變試劑盒用雙引物誘變法成功構(gòu)建了M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA五個(gè)誘變體。用高糖無酚紅DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)COS-7細(xì)胞，用pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞以優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。用RT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)染COS-7后48小時(shí)GR的mRNA的表達(dá)，用Westernblot的方法檢測轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞65小時(shí)后GR的蛋白表達(dá)情況，RT-PCR及Wester

7、nblot的檢測結(jié)果表明野生型GR及各誘變體在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后均有穩(wěn)定表達(dá)。 2.我們在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞48小時(shí)后用放射免疫的方法檢測野生型GR及各誘變體的配體-配基親和力(Kd)及最大結(jié)合容量(RT)。用PRSHGRα質(zhì)粒或各誘變體與PMMTV-CAT質(zhì)粒及PCH110質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，在0、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L地塞米松的作用下觀察野生型GR及各誘變體的轉(zhuǎn)錄功能改變，每種GR

8、質(zhì)粒進(jìn)行三次共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。檢測各GR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后在地塞米松的作用下的TGF-β1制率以評價(jià)檢測各誘變體的抗炎功能：每個(gè)GR質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染進(jìn)行三個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔的對照實(shí)驗(yàn)，第一孔只進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，第二孔和第三孔轉(zhuǎn)染后48小時(shí)加入200ng/ml(培養(yǎng)液終濃度)的LPS(轉(zhuǎn)染+LPS組)，第三孔轉(zhuǎn)染后60小時(shí)加入10-5mol/L的地塞米松(轉(zhuǎn)染+LPS+地塞米松組)，轉(zhuǎn)染72小時(shí)檢測三個(gè)組的TGF-β1的表達(dá)情況，每個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行三個(gè)平行轉(zhuǎn)染

9、實(shí)驗(yàn)。 研究結(jié)果：1.用pEGFP轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞48小時(shí)后獲得比較高的轉(zhuǎn)染效率，可達(dá)70％以上。 2.用RT-PCR的方法均可在GR及各誘變體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞48小時(shí)后檢測到GRmRNA的表達(dá)。 3.用Westernblot的方法檢測GR及各誘變體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞65小時(shí)后均可檢測到分子量為94KD的蛋白質(zhì)表達(dá)。 4.放射性配體-配基競爭抑制實(shí)驗(yàn)測定GR及各誘變體的KD值和RT值顯示：wtGR的K

10、D值為4.25nM，RT值為84.82fmol/mgpro；M565R的KD值為0.126nM，RT值為99.45fmol/mgpro；A573Q的KD值為0.336nM，RT值為88.71fmol/mgpro；C638S的KD值為0.386nM，RT值為98.8fmol/mgpro4；L753F的KD值為42.4nM，RT值為53.31fmol/mgpro：GR2349insA的KD值為46.9nM，RT值為59.62fmol/mgp

11、ro。 5.M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA和在不同濃度地塞米松誘導(dǎo)下和野生型GR的CAT表達(dá)量比較均有顯著性差異(P＜0.05)。其中A573Q的CAT最大激活濃度2倍于野生型GR。M565R、C638S、A573Q在相同的地塞米松作用下CAT的誘導(dǎo)表達(dá)量均高于野生型GR(P＜0.05)：L753F、GR2349insA在相同地塞米松作用下CAT的誘導(dǎo)表達(dá)量均低于野生型GR(P＜0.05)。

12、 6.通過測定wtGR、M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA在地塞米松作用下對LPS誘導(dǎo)的COS-7細(xì)胞的TGF-β1表達(dá)升高的抑制作用，結(jié)果顯示各單純轉(zhuǎn)染細(xì)胞體系的TGF-β1的表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。經(jīng)過LPS作用下再加入10-5mol/L的地塞米松后wtGR、M565R、C638S、A573Q轉(zhuǎn)染組的TGF-β1表達(dá)量與未加地塞米松組相比較顯著降低(P＜0.05)，而L753F、G

13、R2349insA的TGF-β1的表達(dá)量無顯著變化(P＞0.05)。M565R、C638S、A573Q組在地塞米松作用下的TGF-β1表達(dá)抑制率均高于野生型GR(P＜0.05)，而L753F、GR2349insA的TGF-β1的表達(dá)抑制率低于野生型(P＜0.05)。 結(jié)論：1.在PRSHGRα質(zhì)粒的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA的糖皮質(zhì)激素受體α亞型誘變體。 2.wt

14、GR及M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后均可在48～72小時(shí)之內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)GR蛋白。 3.M565R、C638S、A573Q為高親和力受體，L753F、GR2349insA為低親和力受體。 4.M565R、C638S、A573Q的轉(zhuǎn)錄功能顯著高于野生型GR(P＜0.05)，而L753F、GR2349insA的轉(zhuǎn)錄功能顯著低于野生型GR(P＜0.05)。 5.M5