原代奶牛乳腺上皮細胞的分離、培養(yǎng)和傳代的技術(shù)研究.pdf

1、利用動物乳腺來生產(chǎn)藥用蛋白是生物高新技術(shù)中重要的內(nèi)容，對乳腺上皮細胞的探索從未停止。自小鼠轉(zhuǎn)基因起，動物細胞技術(shù)平臺已經(jīng)漸漸地建立起來。乳腺上皮細胞具有分泌性，是一種功能細胞，乳腺正是依靠該細胞來進行泌乳。作為乳腺泌乳的基礎(chǔ)，乳腺上皮細胞對于探究泌乳的啟動、功能維持和退化等生理過程來說，是一種必需的材料，沒有這種材料，無法研究基因表達和信號傳導(dǎo)等問題。
　　目前，體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞存在一些問題，復(fù)雜的過程和有限的傳代次數(shù)導(dǎo)致

2、成功率不是很高。通常情況下，即使培養(yǎng)成功，乳腺上皮細胞也會失去一些生物學(xué)功能，這就使得這些細胞一般僅能用于科學(xué)研究，利用其進行工業(yè)生產(chǎn)等實際應(yīng)用，難度較大。就國內(nèi)而言，成功培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞的示例不多。即使在成功的實例中，對于如何分離、培養(yǎng)和傳代乳腺上皮細胞，也沒有一個比較明確的結(jié)論。由上述背景可以看出，當前亟待解決的問題一個是創(chuàng)立新的方法或者改善現(xiàn)有方法來有效地分離培養(yǎng)和傳代奶牛乳腺上皮細胞，另一個就是建立什么技術(shù)指標來檢測純化的乳

3、腺上皮細胞。所以，研究奶牛乳腺上皮細胞體外分離、培養(yǎng)、傳代技術(shù)是很有意義的。
　　本文研究選取的實驗材料來自于健康的荷斯坦奶牛乳腺組織，使用組織塊接種法體外培養(yǎng)并得到了奶牛乳腺上皮細胞。并且在成功獲得奶牛乳腺上皮細胞后，使用了細胞角蛋白的免疫熒光(IF)染色和蛋白質(zhì)免疫印記(WB)對乳腺上皮細胞進行了鑒定。通過對細胞在分離、培養(yǎng)、傳代中光學(xué)顯微鏡下的觀察和對細胞凍存和復(fù)蘇方法的研究，建立了清楚的原代奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)方法。與此同

4、時，對用不同方法凍存的奶牛乳腺上皮細胞進行復(fù)蘇，而后測定了細胞的貼壁率。除此之外，還檢測了奶牛乳腺上皮細胞中的甘油三酯、乳糖和酪蛋白這些營養(yǎng)物質(zhì)以及細胞的增殖規(guī)律。這些檢測結(jié)果，從各個方面體現(xiàn)出了處于不同代數(shù)的奶牛乳腺上皮細胞泌乳的差異，進而為奶牛乳腺上皮細胞后面的實驗提供了基礎(chǔ)和參考。
　　本實驗結(jié)果表明，通過組織塊貼壁培養(yǎng)法分別分離得到乳腺上皮細胞和成纖維細胞的原代培養(yǎng)物。對經(jīng)過角蛋白的免疫熒光(IF)染色和蛋白質(zhì)免疫印記(W