牛病毒性腹瀉病毒抗原檢測、流行病學(xué)研究及分離株E2基因的克隆表達(dá).pdf

1、以抗BVDV單克隆抗體作為捕獲抗體，與雞抗BVDVIgY(檢測抗體)聯(lián)合應(yīng)用，建立BVDV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法.采用方陣滴定法確定單抗、雞抗BVDVIgY的最適工作濃度，用陰性組織樣品確定判定檢測結(jié)果的OD490臨界值。利用該方法，同時(shí)采用病毒分離和RT—PCR方法檢測臨床糞樣23份，結(jié)果表明：該方法檢測結(jié)果與病毒分離和RT—PCR方法的符合率達(dá)93.75％和83.33％。進(jìn)一步優(yōu)化檢測體系，使其檢測靈敏度達(dá)到27

2、4ng/mL；與冠狀病毒及輪狀病毒無交叉反應(yīng)，但與豬瘟病毒存在弱交叉反應(yīng)；通過引入質(zhì)控血清進(jìn)行質(zhì)控檢驗(yàn)，試劑盒所得檢測結(jié)果均在質(zhì)量控制范圍內(nèi)，達(dá)到預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)化要求；經(jīng)穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)，試劑盒4℃可以保存6個(gè)月，批間和批內(nèi)的變異系數(shù)分別為8.37％和4.31％。初步完成了BVDV抗原捕捉ELISA(AC—ELISA)檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化，為批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。 利用該試劑盒，對新疆北疆6個(gè)大型集約化牛場進(jìn)行BVDV感染調(diào)查，結(jié)果表明

3、：牛場普遍存在著BVDV的感染，呈零星散發(fā)狀態(tài)，看似正常的牛群也存在著一定的感染，發(fā)病牛場感染率達(dá)到100％。進(jìn)一步對各牛場感染病毒進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)特性和基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)感染病毒細(xì)胞培養(yǎng)特性和基因型一致，均為非致細(xì)胞病變型，BVDV-1型病毒。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，有兩株病毒屬于BVDV-1b型，1株屬于BVDV-1c型，其余不屬于已公布的任何亞型，初步確定屬于BVDV一個(gè)新的亞型類群。 應(yīng)用RT-PCR方法及套式PCR克隆得到3株新

4、疆分離株E2基因片段(shihezi148、manasi和MNS2)GenBank登錄號：EU159699、EU159703和EU169937，序列分析結(jié)果表明：三株E2基因長度分別為1121bp、1122bp和1122bp，分別編碼373、374和374個(gè)氨基酸殘基的多肽；核酸序列同源性和系統(tǒng)發(fā)生分析表明，3株病毒均屬于BVDV基因1型(BVDV-1)，shihezi148株與澳大利亞Bega株親緣關(guān)系最近，同處于BVDV-1c基因亞

5、型群，其E2氨基酸同源性為90.11％；manasi株和MNS2株E2基因核酸序列僅有4個(gè)堿基的差別，它們與changchun184和匈牙利VEDEVAC株親緣關(guān)系最近，位于BVDV-1b基因亞型群，manasi和MNS2株與changchun184株E2氨基酸同源性分別高達(dá)98.66％98.93％。 通過基因重組技術(shù)，將Shihezi148株的E2基因克隆到pProEXHTa和pVAX1載體，構(gòu)建得到了去除C端跨膜區(qū)的截短E2

6、基因的原核表達(dá)載體pProEXHTa—E2和包括信號肽和全長E2蛋白的真核重組質(zhì)粒pVAX1-E2；經(jīng)過PCR、酶切及測序表明：pProEXHTa-E2和pVAX1-E2重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。將pProEXHTa-E2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5、JM109和BL21并誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)目的蛋白用SDS—PAGE檢測，目的蛋白沒有表達(dá)；用GenEscortTM試劑轉(zhuǎn)染DVAX1-E2質(zhì)粒、pGFP質(zhì)粒(陽性對照)、空白對照到BHK-21細(xì)胞，pG

7、FP質(zhì)粒表達(dá)檢測表明，綠色熒光蛋白得到了一定的表達(dá)，間接證明目的載體轉(zhuǎn)染后瞬時(shí)表達(dá)，但在pVAX1-E2質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)上清中用SDS-PAGE檢測沒有檢測到表達(dá)的目的蛋白。 對E2基因應(yīng)用軟件預(yù)測及序列分析，構(gòu)建了含有不同抗原表位(1-118)-(144—340)-(100-300)-(1-345)的pET28a-ED1、pET28a-ED2、pET28a-ED3、pET28a—ED4四個(gè)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并誘導(dǎo)目的蛋

8、白的表達(dá)，SDS—PAGE電泳檢測結(jié)果顯示所表達(dá)出了E2A、E2B、E2C、E2D融合蛋白相對分子量分別為18.6KDa、28.2KDa、29.2KDa、43.8KD，與預(yù)測蛋白分子量大小一致。Westernblot分析結(jié)果表明，所表達(dá)的融合蛋白E2B、E2C、E2D被?？笲VDV陽性血清識(shí)別。選擇pET28a-ED4質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化。通過方陣滴定法初步建立了檢測BVDV血清抗體的間接E11