SFRP4在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠病理變化中的作用及其表觀遺傳學(xué)修飾.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫異常的、系統(tǒng)性多關(guān)節(jié)性疾病，成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes, FLS)在RA病理機制中起關(guān)鍵作用。Wnt信號影響 RA病理機制，對RA病理發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Masala等研究發(fā)現(xiàn)在脊髓發(fā)育不良的髓細(xì)胞，分泌型卷曲相關(guān)蛋白4(Secreted Frizzled-Related Protein4，SFRP4)發(fā)生表觀遺

2、傳學(xué)修飾致其表達(dá)降低，誘發(fā) Wnt信號激活。在 RA病理變化中，是否也存在 SFRP4表達(dá)變化，Wnt信號影響 RA的病理變化是否與SFRP4有關(guān)？佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis, AA)具有與RA相似的病理學(xué)、免疫學(xué)特點，是理想的RA動物模型。本實驗采用 AA大鼠作為RA研究動物模型，研究SFRP4在對照組大鼠和AA大鼠滑膜中的表達(dá)變化，及其對Wnt信號的影響，深入研究在AA病理中SFRP4基因發(fā)生的表觀遺傳學(xué)修飾

3、，揭示甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl CpG binding protein2, MeCP2)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase1, DNMT1)對SFRP4表達(dá)的影響，以及 microRNA(miR)-152在其中發(fā)揮的重要作用，為RA的研究與防治提供新的思路。研究內(nèi)容主要包括以下五個部分：
　　1. SFRP4在AA大鼠滑膜中的表達(dá)，及其與Wnt信號的關(guān)系。
　　免疫組化、RT-PCR和

4、Western blotting檢測SFRP4在對照大鼠和AA大鼠滑膜組織中的表達(dá)變化，分離培養(yǎng)對照大鼠和AA大鼠FLS，RT-PCR和Western blotting檢測SFRP4在對照大鼠和AA大鼠FLS中的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，SFRP4在AA大鼠滑膜組織和FLS中表達(dá)均顯著降低，提示異常表達(dá)的SFRP4可能對AA病理機制發(fā)揮調(diào)控作用。為了研究SFRP4在AA大鼠中對Wnt信號的調(diào)控作用，分離培養(yǎng)對照大鼠滑膜FLS，培養(yǎng)

5、液中加入SFRP4抗體，采用real time qPCR和Western blotting檢測SFRP4抗體對對照大鼠FLS Wnt信號通路關(guān)鍵基因β-catenin表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SFRP4抗體顯著上調(diào)對照大鼠FLS的β-catenin表達(dá)。為進(jìn)一步驗證SFRP4對Wnt信號的影響， AA大鼠FLS培養(yǎng)液中加入重組SFRP4蛋白， Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)重組SFRP4蛋白能顯著抑制AA大鼠FLS的β-caten

6、in、fibronectin表達(dá)。提示SFRP4可能通過抑制Wnt信號影響AA病理變化。
　　2. DNA甲基化特異性抑制劑(5-aza-2'-deoxycytidine,5-azadC)對AA大鼠SFRP4表達(dá)的影響。
　　采用RT-PCR、Western blotting、MTT等實驗方法檢測5-azadC刺激AA大鼠FLS對SFRP4表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5μM,5.0μM,7.5μM劑量的5-azadC分別刺激AA

7、大鼠FLS均能顯著上調(diào)SFRP4表達(dá)，5μM5-azadC分別刺激培養(yǎng)AA大鼠FLS24、48、72h后SFRP4表達(dá)均顯著升高，提示AA病理中SFRP4基因可能發(fā)生了DNA甲基化修飾致其表達(dá)降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)5μM5-azadC刺激AA大鼠FLS24、48、72h后均能顯著抑制經(jīng)典Wnt信號通路關(guān)鍵基因β-catenin、ccnd1表達(dá)。同時5μM5-azadC刺激AA大鼠FLS24、48、72h后均能顯著抑制fibronectin

8、表達(dá)和AA大鼠FLS增殖。上述結(jié)果綜合提示，AA病理中SFRP4低表達(dá)可能與SFRP4基因發(fā)生了DNA甲基化修飾有關(guān)，而5-azadC能上調(diào)SFRP4表達(dá)，進(jìn)而能抑制β-catenin、ccnd1、fibronectin表達(dá)，表明SFRP4可能通過Wnt信號通路影響AA病理變化。
　　3. MeCP2對AA大鼠SFRP4表達(dá)的影響
　　采用RT-PCR和Western blotting檢測MeCP2在對照大鼠和AA大鼠滑膜組

9、織中的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，MeCP2在AA大鼠滑膜組織中表達(dá)顯著升高， RT-PCR和Western blotting檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在AA大鼠FLS中，MeCP2表達(dá)顯著高于對照。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siMeCP2至AA大鼠FLS，研究MeCP2表達(dá)抑制對SFRP4表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeCP2表達(dá)抑制后，SFRP4表達(dá)顯著升高。以上實驗結(jié)果提示，AA病理中異常高表達(dá)的MeCP2可能與抑制

10、SFRP4表達(dá)有關(guān)。
　　4. DNMT1對AA大鼠SFRP4表達(dá)的影響
　　Real time qPCR和Western blotting檢測DNMT1在對照大鼠和AA大鼠滑膜組織中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，在AA大鼠滑膜組織中DNMT1表達(dá)顯著上調(diào)， real time qPCR和Western blotting檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DNMT1在AA大鼠FLS中的表達(dá)顯著高于對照，DNMT1表達(dá)抑制后SFRP4表達(dá)顯著升高。

11、以上實驗結(jié)果提示，AA病理中異常高表達(dá)的DNMT1可能與SFRP4表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
　　5. MiR-152對AA大鼠SFRP4的作用及信號通路
　　采用real time qPCR、Western blotting、MTT等方法檢測miR-152在對照大鼠和AA大鼠中的表達(dá)差異及其對DNMT1表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究過表達(dá)的miR-152對SFRP4表達(dá)的影響，對Wnt信號的影響和對AA的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-152在AA

12、大鼠中表達(dá)顯著下調(diào)，過表達(dá)的miR-152抑制DNMT1的表達(dá)，上調(diào)SFRP4的表達(dá)，抑制經(jīng)典Wnt信號，抑制AA大鼠FLS異常增殖。以上實驗結(jié)果提示，miR-152具有抑制AA的作用，并且這種抑制作用可能是通過對DNMT1表達(dá)的抑制和對Wnt信號的抑制實現(xiàn)的。
　　綜上所述，在AA大鼠中SFRP4基因可能發(fā)生表觀遺傳學(xué)修飾致其表達(dá)降低，進(jìn)而引發(fā)Wnt信號激活，促進(jìn)AA的發(fā)生發(fā)展。在AA大鼠中高表達(dá)的DNMT1和MeCP2可能抑制