重組布氏乳桿菌漆酶表達的研究.pdf

1、我國作為農(nóng)業(yè)大國每年秸稈的產(chǎn)量非常高，但是僅有少量被用于工業(yè)生產(chǎn)，大多數(shù)都被作為廢棄物直接傾入環(huán)境，這樣形成了非常大的污染以及浪費秸稈被用于制作青貯飼料是使秸稈“變廢為寶”的有效途徑之一，而秸稈能否被有效利用取決于木質(zhì)素能否有效降解。木質(zhì)素作為青貯飼料的添加劑可以大大提高其利用率，但由于其產(chǎn)量較低無法滿足工農(nóng)業(yè)需求。據(jù)報道稱漆酶已在多種宿主細胞中實現(xiàn)異源表達，以求提高其產(chǎn)量。而乳酸菌是食品級安全微生物，若能作為宿主細胞異源表達漆酶，構(gòu)建

2、重組工程乳酸菌作為新型微生物制劑添加于青貯飼料中，將發(fā)揮乳酸菌與漆酶的雙重功能，漆酶是重要的木質(zhì)素降解酶，具有分泌漆酶功能的重組乳酸菌若用于青貯飼料的發(fā)酵，可以大大提高飼料的利用率及飼料的品質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　本研究是在將杏鮑菇漆酶基因轉(zhuǎn)入乳酸桿菌中的基礎(chǔ)上，研究該重組乳酸菌是否能表達漆酶，并且研究該漆酶的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)和功能，為將具有分泌漆酶功能的乳酸菌添加于青貯飼料中提供基礎(chǔ)依據(jù)。本實驗室將杏鮑菇漆酶基因接入食品級宿主

3、細胞乳酸菌中，成功構(gòu)建重組工程乳酸菌。本研究將獲得的乳酸菌工程菌株進行擴大培養(yǎng)，獲得重組菌分泌的漆酶，研究了該漆酶的酶學(xué)特性。進行了如下試驗:
　　1.為篩選出單個轉(zhuǎn)化株，將重組工程乳酸菌液涂布到含有紅霉素的固體MRS培養(yǎng)基中，挑取轉(zhuǎn)化子的菌落進行PCR，然后篩選陽性重組乳酸菌。
　　2.并提取篩選到的陽性重組子質(zhì)粒，進一步進行PCR驗證。
　　3.將驗證過確實存在漆酶基因的陽性重組子涂布到含有0.04％愈創(chuàng)木酚的MR

4、S固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，表達產(chǎn)物用平板顯色法實驗進行檢測，重組乳酸菌若能產(chǎn)生漆酶菌落顏色會變成紅棕色，表明該重組子具有分泌漆酶的能力，挑取顏色變化較深的菌落，搖瓶培養(yǎng)并用ABTS測定其表達的漆酶活性。
　　4.比較重組工程乳酸菌與原載體乳酸菌的產(chǎn)酸性能。
　　成功篩選到具有產(chǎn)漆酶能力的重組工程乳酸菌，對其適宜溫度、酸堿度進行了研究。
　　實驗結(jié)果表明:重組工程乳酸菌具有表達漆酶的能力，但其分泌的漆酶酶活性相對很低，酶活