HIV gag DNA疫苗誘導小鼠特異性免疫應答的研究.pdf

1、艾滋病，又名獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，是一種由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的傳染性疾病。該病傳播迅速，死亡率極高，被稱為“二十世紀瘟疫"。研制安全且有效的疫苗對于控制艾滋病的傳播非常重要。在過去，人們曾一度認為，誘導機體產(chǎn)生針對HIV包膜蛋白的體液免疫應答是艾滋病疫苗研制的主要方向。然而由于病毒的逃逸

2、作用，疫苗誘導的中和抗體被證實難以有效的完全防御HIV的入侵。科學家們發(fā)現(xiàn)，艾滋病病原體的gag基因及所編碼蛋白在序列上相對比較保守，是疫苗研制的理想標靶。臨床研究指出，在HIV感染者中有一群長期感染但無發(fā)病的個體，他們體內(nèi)存在著相對高水平的Gag-特異性CTL應答。另一些研究表明，針對Gag-p17的CTL應答與患者病毒載量呈負相關(guān)。以上發(fā)現(xiàn)提示了針對艾滋病病毒Gag抗原的疫苗能夠增強機體的保護性免疫反應。目前，世界不同國家針對gag

3、基因及其編碼產(chǎn)物已經(jīng)開發(fā)出許多相應的疫苗候選物，其有效性以及安全性尚在實驗研究階段。在所有疫苗候選物中，DNA疫苗是研究的一大熱點，被稱為“疫苗的第三次革命”。研究證實，DNA疫苗能夠在多種動物體內(nèi)同時誘導體液免疫與細胞免疫應答，給HIV感染的防治帶來了益處。 為了研究HIV gag DNA疫苗誘導抗原特異性的細胞免疫應答的產(chǎn)生與維持，本實驗室利用分子生物學技術(shù)構(gòu)建出HIV gag DNA疫苗，其核心序列為HIV(HXBc2病毒

4、株)的gag完整序列片斷。我們采用C57BL/6小鼠為實驗模型，以肌肉注射法對其進行HIV gag DNA疫苗免疫，分別于不同時間點后獲取脾與肺組織的單個細胞，在體外對其加入Gag抗原多肽刺激后，采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平，ELISPOT法檢測IFN-γ分泌細胞的頻率，流式細胞儀分析不同的特異性T細胞亞群及表型。結(jié)果顯示：末次免疫1周后，經(jīng)Gag多肽刺激的加強免疫組小鼠脾內(nèi)及肺組織內(nèi)IFN-γ產(chǎn)生的總體水平和分泌

5、細胞頻率均高于對照組及初次免疫組(P<0.05)，表明了加強免疫HIVgagDNA疫苗比初次免疫更能誘導小鼠產(chǎn)生抗原特異性的細胞免疫效應。而且該效應同時存在于淋巴組織(脾)與非淋巴組織(肺)之中。運用流式細胞儀技術(shù)，我們又發(fā)現(xiàn)，HIVgagDNA疫苗能同時誘導CD4<'+>和CD8<'+>兩群T細胞產(chǎn)生應答。疫苗學的基礎(chǔ)在于提供長期、有效的免疫記憶。為了探討HIV gag DNA疫苗誘導的特異性細胞免疫記憶應答，我們在末次免疫5周后，對

6、抗原特異性IFN-γ做了進一步的檢測：經(jīng)多肽刺激后，加強免疫組IFN-γ的總體產(chǎn)生水平和分泌細胞頻率同樣均高于對照組及初次免疫組(P<0.05)。無論從總體水平還是從單細胞水平檢測的結(jié)果表明，小鼠加強免疫HIV gag DNA疫苗后其淋巴器官(脾)與非淋巴器官(肺)內(nèi)均存在有應答功能的記憶性T細胞。證明了加強免疫疫苗與初次免疫相比，在誘導出更明顯的細胞免疫效應的同時也保持了更高水平的細胞免疫記憶。這些發(fā)現(xiàn)提示我們在利用HIV gag D

7、NA疫苗進行免疫時選擇“初免+加強”方式的必要性。 流式細胞技術(shù)分析得出，加強免疫組淋巴器官與非淋巴器官內(nèi)均存在CD4<'+>和CD8<'+>兩群抗原特異性記憶性T細胞，其中抗原特異性CD8<'+>記憶性T細胞所占的比例高于CD4<'+>記憶性T細胞，在非淋巴器官中的分布尤為顯著。最近的研究指出，記憶性T細胞表達CD127對于其長期存活具有十分重要的意義。本實驗中，疫苗誘導Gag-特異性記憶T細胞的主要表型為CD62L<'->C

8、D127<'+>，屬于效應型記憶T細胞，它們在免疫應答的晚期主要存在于非淋巴器官，提供迅速的保護作用。 不同抗原特異性的免疫記憶在體內(nèi)維持的時間長短不一。實驗結(jié)果表明，HIVgagDNA疫苗誘導的Gag抗原特異性T細胞免疫記憶至少可以維持16周。如何延長疫苗誘導免疫記憶的維持時間，有賴于進一步的研究。 理想的艾滋病疫苗不但要在人體內(nèi)誘導足夠強的細胞免疫應答，同時也要誘導出體液免疫應答，才能從不同途徑阻止HIV在體內(nèi)復制。

9、為了全面評價HIV gagDNA疫苗的作用，我們還利用間接ELISA技術(shù)對不同免疫組小鼠的血清進行了抗原特異性抗體IgG的檢測。末次免疫1周及5周后的ELISA結(jié)果提示，與初次免疫相比，加強免疫HIV gag DNA疫苗能誘導小鼠產(chǎn)生更高水平、個體差異更小的Gag-特異性IgG，進一步鞏固了我們對“初免+加強"免疫方式的信心。通過對不同時間點實驗結(jié)果的分析，我們發(fā)現(xiàn)，加強免疫HIV gag DNA疫苗誘導的體液免疫應答可以長期維持。至少