CD2AP在足細(xì)胞中的生理功能研究.pdf

1、第一部分、CD2AP在腎臟細(xì)胞中的分布及其在足細(xì)胞中的作用初探。 目的：觀察CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）在腎臟不同細(xì)胞系中的表達(dá)分布，及其與足細(xì)胞裂孔隔膜分子nephrin和細(xì)胞骨架蛋白F-actin之間的聯(lián)系。 方法：以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人系膜細(xì)胞（HMC）和人腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2），RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)條件永生化小鼠足細(xì)胞系。以RT-PCR及Western blot方法檢測足細(xì)胞內(nèi)CD2AP和nephr

2、in的表達(dá)。間接免疫熒光結(jié)合激光共聚焦方法觀察CD2AP在HMC、HK-2、未分化及已分化足細(xì)胞中的表達(dá)情況，及CD2AP與nephrin在足細(xì)胞中的共存。直接免疫熒光結(jié)合激光共聚焦方法觀察F-actin在足細(xì)胞的表達(dá)及其與CD2AP的共存。 結(jié)果：CD2AP均勻分布于HK-2及未分化足細(xì)胞的核周及胞漿，而不表達(dá)于HMC細(xì)胞。在足細(xì)胞分化過程中，CD2AP的分布發(fā)生了變化，出現(xiàn)向周邊聚集的現(xiàn)象。CD2AP與足細(xì)胞裂孔隔膜分子ne

3、phrin及細(xì)胞骨架蛋白F-actin在足細(xì)胞中存在共定位關(guān)系。 結(jié)論：CD2AP表達(dá)于上皮來源的腎臟固有細(xì)胞。CD2AP在足細(xì)胞中的分布特點(diǎn)，提示CD2AP可能參與足細(xì)胞的分化過程，并與裂孔隔膜分子功能及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)。 第二部分、CD2AP在足細(xì)胞中的生理功能研究。 論文1：CD2AP在足細(xì)胞分化中的作用。 目的：本文旨在研究未分化和分化足細(xì)胞生物學(xué)性狀及CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）在足細(xì)胞分化過程

4、中的作用。 方法：體外33 ℃許可條件下培養(yǎng)由H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠所建立的未分化足細(xì)胞系，并在37 ℃非許可條件下誘導(dǎo)其分化。觀察足細(xì)胞分化后形態(tài)學(xué)改變；MTT法測定細(xì)胞的生長曲線；紅色熒光染料PKH-26標(biāo)記足細(xì)胞，追蹤其在子代細(xì)胞中的分布，檢測細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的改變；Western印跡檢測足細(xì)胞相關(guān)蛋白CD2AP、α-actinin和足細(xì)胞分化相關(guān)蛋白nephrin的表達(dá)；免疫熒光結(jié)合激光共聚

5、焦方法檢測CD2AP、nephrin、α-actinin、F-肌動蛋白和微管蛋白的表達(dá)變化。用CD2AP siRNA轉(zhuǎn)染未分化足細(xì)胞后置于37℃非許可條件下培養(yǎng)，并設(shè)非許可條件下未轉(zhuǎn)染組為對照組。檢測足細(xì)胞的生長速度的變化以及足細(xì)胞分化標(biāo)志物synaptopodin的表達(dá)。 結(jié)果：與未分化足細(xì)胞相比，分化足細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，生長速度減慢，增殖能力下降（P<0.05）；細(xì)胞周期表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞比例的增多和S期及G2/M期的細(xì)

6、胞比例下降（P<0.05）；CD2AP、nephrin和α-actinin的表達(dá)明顯增高（P<0.05）；CD2AP、nephrin、α-actinin、F-肌動蛋白和微管蛋白在表達(dá)分布上均發(fā)生明顯的改變。Synaptopodin僅表達(dá)于已分化足細(xì)胞，在未分化足細(xì)胞無表達(dá)。轉(zhuǎn)染特異性siRNA下調(diào)CD2AP表達(dá)后，細(xì)胞生長速度明顯減慢，synaptopodin mRNA表達(dá)下調(diào)（P<0.05），細(xì)胞分化遲滯。 結(jié)論：足細(xì)胞分化過

7、程中伴隨細(xì)胞骨架的重新分布和細(xì)胞形態(tài)的改變；CD2AP可能作為足細(xì)胞裂孔隔膜分子與細(xì)胞骨架的連接蛋白，在足細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。 論文2：CD2AP在足細(xì)胞增殖和分裂中的作用。 目的：觀察敲低足細(xì)胞CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）表達(dá)對細(xì)胞增殖和分裂的影響，探討CD2AP在足細(xì)胞損傷和蛋白尿發(fā)病機(jī)理中的作用。 方法：采用RPMI 1640培養(yǎng)基，在33℃許可條件下培養(yǎng)永生化小鼠足細(xì)胞系。以PKH-26紅色熒光染

8、料標(biāo)記足細(xì)胞后，用Metafectene轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染針對CD2AP的小分子干擾RNA（siRNA）。轉(zhuǎn)染24h后流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率；48h 后RT-PCR和Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后CD2AP mRNA和蛋白表達(dá)；72h后以流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞增殖指數(shù)及細(xì)胞周期；用Oregon Green? 488標(biāo)記的Paclitaxel直接標(biāo)記足細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白，激光共聚焦顯微鏡下檢測雙核及多核足細(xì)胞的比例。 結(jié)果：流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示

9、，CD2AP特異性siRNA轉(zhuǎn)染效率為66.27％。轉(zhuǎn)染siRNA 48h后，CD2AP mRNA和蛋白表達(dá)分別下降57％和39％。轉(zhuǎn)染72h后，足細(xì)胞增殖指數(shù)明顯下降（p<0.05），G2/M期的細(xì)胞數(shù)量明顯增多（p<0.05）。共聚焦顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染CD2AP siRNA后，部分細(xì)胞有絲分裂后不能分離，雙核及多核足細(xì)胞的比例明顯增加（p<0.05）。 結(jié)論：CD2AP表達(dá)降低可能通過阻礙足細(xì)胞增殖和有絲分裂，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。

10、 論文3：CD2AP在足細(xì)胞黏附和胞質(zhì)伸展中的作用。 目的：觀察抑制足細(xì)胞CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）表達(dá)對細(xì)胞黏附和胞質(zhì)伸展功能的影響，并初步探討其機(jī)制。 方法：用RPMI 1640培養(yǎng)基33℃下培養(yǎng)小鼠未分化足細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染針對CD2AP的小分子干擾RNA（siRNA），設(shè)無特異靶位點(diǎn)的Scrambing序列即Control siRNA轉(zhuǎn)染組作對照。48h后將轉(zhuǎn)染的足細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，接種于預(yù)鋪有Ⅳ型膠原蛋

11、白的96孔板內(nèi)，33℃下培養(yǎng)90min后檢測足細(xì)胞的貼壁率和細(xì)胞的伸展面積，流式細(xì)胞儀檢測抑制CD2AP后足細(xì)胞的凋亡率以及在不同PAN刺激下足細(xì)胞的凋亡率。激光共聚焦顯微鏡下檢測微絲蛋白的分布變化。Western印跡和免疫共沉淀檢測nephrin蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染CD2AP siRNA足細(xì)胞的黏附率和細(xì)胞伸展的面積明顯低于對照組（P<0.05）；轉(zhuǎn)染CD2AP siRNA后48h足細(xì)胞的凋亡率高于對照組，有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。100μg/ml的PAN能明顯誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡，減少足細(xì)胞的黏附率（P<0.05）。敲低CD2AP的表達(dá)后足細(xì)胞微絲蛋白的分布發(fā)生明顯的變化，nephrin蛋白表達(dá)和磷酸化水平下降（P<0.05）。 結(jié)論：敲低CD2AP的表達(dá)使足細(xì)胞易于凋亡，影響細(xì)胞的黏附功能；足細(xì)胞骨架蛋白的紊亂和nephrin信號通路的抑制可能是足細(xì)胞黏附和伸展功能下降的機(jī)制。 第三部分、CD2AP在白蛋白內(nèi)吞中的作用機(jī)

13、制初探。 目的：觀察足細(xì)胞對白蛋白的吞噬作用以及白蛋白過負(fù)荷對足細(xì)胞的損傷，并探討CD2AP在其中的作用。 方法：本研究采用化學(xué)方法制備FITC標(biāo)記的白蛋白，在33℃許可條件下培養(yǎng)由H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠所建立的未分化足細(xì)胞系，并模擬體內(nèi)足細(xì)胞在腎小球鮑曼氏囊內(nèi)所處的蛋白尿環(huán)境，免疫熒光結(jié)合激光共聚焦方法研究足細(xì)胞對白蛋白的吞噬功能以及 CD2AP與FITC-BSA在足細(xì)胞中的共定位，Western印跡檢測CD

14、2AP的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞的凋亡，透射電鏡檢測細(xì)胞的超微結(jié)果變化。 結(jié)果：在生理范圍尿白蛋白濃度下（0.05mg/ml），即可發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞對白蛋白具有吞噬功能。在大劑量白蛋白濃度下（1mg/ml），足細(xì)胞吞噬白蛋白存在時間效應(yīng)，呈S型曲線，在2h后達(dá)到平衡狀態(tài)。激光共聚焦顯微鏡證實(shí)在CD2AP與FITC-BSA在足細(xì)胞內(nèi)存在共聚關(guān)系。BSA刺激12h后CD2AP的表達(dá)明顯上調(diào)，凋亡的足細(xì)胞增多，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。