細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域（脂筏）-Flot調(diào)控MAPK激酶及逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞耐藥性的研究.pdf

1、目的:
　　1.構(gòu)建耐藥肝癌細(xì)胞模型。
　　2.檢測(cè)Flot下調(diào)對(duì)ERK1/2信號(hào)通路的影響，明確能否通過Flot調(diào)控ERK1/2信號(hào)通路從而實(shí)現(xiàn)肝癌細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)。
　　3.檢測(cè)脂筏破壞劑甲基-β-環(huán)糊精破壞脂筏結(jié)構(gòu)對(duì)ERK1/2的影響，探索脂筏與ERK1/2之間的關(guān)聯(lián)。
　　4.檢測(cè)下調(diào)Flot對(duì)耐藥肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　5.構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒Flot1/pcDNA3.1(+)、Flot2/pcD

2、NA3.1(+)，為后續(xù)研究工作奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.用阿霉素大劑量沖擊法誘導(dǎo)細(xì)胞，Celltiter-Glo熒光細(xì)胞活性檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。
　　2.設(shè)計(jì)siRNA和shRNA，Real-Time-PCR和Western Blotting篩選出對(duì)Flot的下調(diào)效果更佳的方法。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用該方法下調(diào)Flot; Western Blotting方法檢測(cè)各組細(xì)胞中C-RAF、MEK1/2、ERK1/2

3、的表達(dá)水平。
　　3.用脂筏破壞劑甲基-β-環(huán)糊精破壞脂筏結(jié)構(gòu)，激光共聚焦顯微鏡驗(yàn)證其作用效果，Western Blotting方法檢測(cè)脂筏破壞后細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的表達(dá)水平。
　　4.體外劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Flot下調(diào)后細(xì)胞越過劃痕區(qū)距離的變化。
　　5.PCR擴(kuò)增Flot序列，將其插入pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒Flot1/pcDNA3.1(+)、Flot2/pcDNA3.1(+)。
　　結(jié)果:

4、
　　1.阿霉素誘導(dǎo)得到的兩株肝癌細(xì)胞株SMMC-7721/ADM和BEL-7402/ADM耐藥指數(shù)分別為16.44和20.34，符合高度耐藥。
　　2.與shRNA方法比較，siRNA方法沉默效率更高，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用siRNA干擾的方法下調(diào)Flot。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞磷酸化C-RAF，磷酸化MEK1/2表達(dá)水平水平明顯降低，且siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)間越長(zhǎng)，下調(diào)效果越明顯;非磷酸化C-RAF，MEK1/2表達(dá)水平未受明顯影響

5、。磷酸化ERK1/2表達(dá)水平先短暫升高后逐漸降低，最后明顯低于對(duì)照組水平;非磷酸化ERK1/2表達(dá)未受明顯影響。
　　3.與對(duì)照組相比，經(jīng)甲基-β-環(huán)糊精作用后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在共聚焦顯微鏡下觀察到的綠色熒光明顯減少，且其磷酸化ERK1/2顯著降低。
　　4.siRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞組比對(duì)照組細(xì)胞越過劃痕區(qū)距離明顯縮短。
　　5.重組質(zhì)粒Flot1/pcDNA3.1(+)、Flot2/pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)入細(xì)胞后Flot

6、-1、Flot-2表達(dá)水平明顯升高。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建耐藥肝癌細(xì)胞模型SMMC-7721/ADM和BEL-7402/ADM。
　　2.下調(diào)Flot后ERK1/2信號(hào)通路被抑制，這為通過Flot調(diào)控ERK1/2信號(hào)通路從而實(shí)現(xiàn)耐藥性的逆轉(zhuǎn)提供理論依據(jù)。
　　3.脂筏參與調(diào)控ERK1/2的激活。
　　4.Flot的表達(dá)水平影響肝癌細(xì)胞侵襲能力。
　　5.成功構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒Flot1/pcDNA