Real-time PCR檢測(cè)水體日本血吸蟲(chóng)尾蚴和小鼠感染早期檢測(cè)的研究.pdf

1、目的：(1)比較日本血吸蟲(chóng)DNA重復(fù)序列psjrh1．0(U92488．1)、18S小亞基單位核糖體核酸基因(18SrRNA)序列(AY157226．1)和sjR2的G55A聲隆(AF412221．1)在基因組中的豐度，初步確定SYBR GreenⅠ熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RQ—PCR)方法檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)的較適宜靶基因和反應(yīng)條件。(2)建立SYBRGreenⅠ熒光RQ—PCR檢測(cè)水體中日本血吸蟲(chóng)DNA的方法，作DNA濃度對(duì)數(shù)和初始循環(huán)數(shù)(C

2、t值)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)方法的可靠性。(3)定量檢測(cè)水體中日本血吸蟲(chóng)尾蚴，作尾蚴數(shù)的對(duì)數(shù)和Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)估水體中日本血吸蟲(chóng)尾蚴的數(shù)量。(4)比較RQ—PCR法與ELISA法的早期檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染的效果，選擇較好的早期診斷方法。
　　 方法：(1)設(shè)計(jì)常規(guī)PCR引物，建立溫度梯度PCR，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確定保守序列。(2)根據(jù)測(cè)序結(jié)果，針對(duì)三個(gè)重復(fù)序列的保守序列設(shè)計(jì)RQ—PCR引物，通過(guò)建立溫度梯度和濃度梯度RQ—

3、PCR，確定豐度較高的靶序列。(3)在較適宜的反應(yīng)條件下，作日本血吸蟲(chóng)DNA濃度對(duì)數(shù)和Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相關(guān)系數(shù)。(4)繪制日本血吸蟲(chóng)尾蚴數(shù)量和Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相關(guān)系數(shù)。(5)分別用ROSE法和全基因組提取試劑盒提取5、10和20條尾蚴感染第2、4、6、8和15天的小鼠血清中DNA，用RQ—PCR進(jìn)行檢測(cè)；用ELISA法檢測(cè)第1、2、3和4w感染尾蚴的小鼠血清中抗日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體抗原的IgG，確定可檢測(cè)到小鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴的

4、最早時(shí)間。
　　 結(jié)果：(1)普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電脈，表明：psjrh1．0和18SrRNA在退火溫度57．4℃下，引物濃度為20pmol時(shí)，反應(yīng)體系較佳；G55A在退火溫度58．8℃下，引物濃度為20pmol時(shí)，反應(yīng)體系較佳。對(duì)其測(cè)序結(jié)果表明：psjrh1．0的產(chǎn)物與NCBI發(fā)表序列比較，只有一個(gè)堿基不同；18SrRNA的產(chǎn)物與NCBI發(fā)表序列比較，完全相同；而G55A的變異性較大，與NCBI發(fā)表序列比較，有20多個(gè)

5、堿基不同。(2)設(shè)計(jì)熒光RQ—PCR引物，擴(kuò)增片段約為160bp，溫度梯度PCR表明：三個(gè)重復(fù)序列的最佳反應(yīng)條件為退火溫度58℃；與18SrRNA和G55A比較，psjrh1．0在基因組中的豐度最高。(3)以psjrh1．0為靶序列建立RQ—PCR可檢測(cè)到日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)基因組DNA的濃度為2fg，用配套軟件繪制2fg～2×108fg的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0．9977，而對(duì)DNA為0．2fg的濃度下和陰性對(duì)照雙蒸水的檢測(cè)結(jié)果為陰性。重復(fù)實(shí)

6、驗(yàn)表明，其變異系數(shù)小于2％，可靠性很好。(4)分別提取1、5、10、20和80條日本血吸蟲(chóng)尾蚴的DNA，建立尾蚴條數(shù)的對(duì)數(shù)和Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)為0．9186，相關(guān)性良好。重復(fù)實(shí)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的變異系數(shù)都小于3％，可靠性良好。(5)對(duì)ROSE法和試劑盒法提取感染小鼠血清中DNA的檢測(cè)結(jié)果表明：ROSE法較試劑盒法的檢測(cè)陽(yáng)性率更高。感染10條尾蚴的小鼠第2w的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而用ELISA法檢測(cè)第4w仍為陰性。
　　 結(jié)論：