TGEV S基因減毒鼠傷寒沙門氏菌重組活載體疫苗株的初步構(gòu)建.pdf

1、本研究成功克隆了豬傳染性胃腸炎SC-H株S蛋白A、D抗原位點基因S1和熱敏腸毒素B亞單位基因LTB，并構(gòu)建了S1及與LTB融合的重組表達載體pYA3342-S1和pYA3342-LTB-S1。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌X3730和NX4550，獲得了2株能穩(wěn)定表達TGEVS蛋白減毒鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)疫苗株，為TGEV口服活載體疫苗的開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)。 1.豬傳染性胃腸炎S1基因片段和熱敏腸毒

2、素B亞單位基因的克隆 本實驗根據(jù)已發(fā)表的TGEVSC-H株S基因cDNA序列設(shè)計并合成一對特異性引物，以pMD19T-S質(zhì)粒為模板，PCR擴增得到964bp的編碼TGEVS蛋白A和D抗原位點的基因片段，并推導(dǎo)出321aa氨基酸序列，構(gòu)建了克隆載體pMD19T-S1。根據(jù)Genbank上的豬源ETEC的LTB序列(M17873)，設(shè)計并合成一對特異性引物，PCR擴增得到395bp的基因片段，并推導(dǎo)出131aa氨基酸序列，構(gòu)建了克隆

3、載體pMD19T-LTB。用DNAstar軟件將測序結(jié)果中LTB的ORF與GenBank中收錄的豬源ETEC菌的LTB基因參考序列(M17873)相比較，其核苷酸同源性為100％。 2.減毒沙門氏菌表達TGEVS蛋白疫苗株的構(gòu)建 首先將LTB基因通過EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點轉(zhuǎn)移到pVAX載體上，然后再將S1基因通過BamHⅠ和HindⅢ插入pVAX-LTB中，接著利用EcoRⅠ和HindⅢ將pVAX-LTB-S1質(zhì)

4、粒中的LTB-S1片段轉(zhuǎn)入pYA3342質(zhì)粒，最終得到沙門氏菌表達載體pYA3342-LTB-S1。同時，利用BamHⅠ和HindⅢ酶切位點將S1基因通過插入pYA3342質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pYA3342-S1。 將pYA3342-S1和pYA3342-LTB-S1分別依次電轉(zhuǎn)化X3730和X4550沙門氏菌，得到減毒沙門氏菌X4550(pYA3342-S1)和X4550(pYA3342-LTB-S1)；用SDS-PAGE分析

5、在終濃度為1mmol/LIPTG的誘導(dǎo)下減毒沙門氏菌表達產(chǎn)物，結(jié)果表明S基因及與LTB融合基因在減毒沙門氏菌表達系統(tǒng)中都獲得表達，表達的重組蛋白分別約為37kDa和49kDa。 3.重組疫苗株的生物學(xué)特性初步研究 本實驗構(gòu)建的2株重組菌生長特性方面與X4550(pYA3342)相比沒有顯著變化；同時在LB(DAP+)液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳10代后，含重組質(zhì)粒的菌株達到98％以上。1×1010或1×1011CFU重組菌X455