鉗蝎鎮(zhèn)痛活性肽(AS)表達(dá)產(chǎn)物的體外變復(fù)性.pdf

1、通過外源基因在E.coli中的表達(dá)來獲得蛋白質(zhì)類藥物,已經(jīng)成為生產(chǎn)基因工程藥物的重要手段,如何對包涵體蛋白進(jìn)行高濃度、高收率的復(fù)性,是重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的關(guān)鍵性技術(shù)之一。本文對鉗蝎鎮(zhèn)痛活性肽(AS)包涵體的重折疊復(fù)性進(jìn)行了研究,以有助于這一問題的解決。
　　 首先,將鉗蝎鎮(zhèn)痛活性肽(AS)的基因克隆到質(zhì)粒pET28a上,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET28a-AS,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析其可溶性,結(jié)果表明大部分以包涵體的形

2、式存在,表達(dá)量約占菌體總蛋白的31％:將鉗蝎鎮(zhèn)痛活性肽(AS)的基因克隆到質(zhì)粒pET28a上,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET28a-His-AS,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析其可溶性,結(jié)果表明大部分以包涵體的形式存在,表達(dá)量約占菌體總蛋白的35％。
　　 將含有表達(dá)質(zhì)粒pET28a-AS和表達(dá)質(zhì)粒pET28a-His-AS的菌體蛋白進(jìn)行超聲波破碎,離心后得到包涵體沉淀。分別用Triton X-100和1M的鹽酸胍分別洗滌包

3、涵體,包涵體蛋白經(jīng)8M鹽酸胍變性后,采用分步稀釋法使變性蛋白的終濃度為0.1mg/ml,復(fù)性后得到的蛋白收率分別為22.6％和23.2％。
　　 將復(fù)性后得到的蛋白進(jìn)行柱層析分離純化。含表達(dá)質(zhì)粒pET28a-AS的包涵體蛋白復(fù)性后經(jīng)SP Sepharose Fast Flow層析柱后,SDS-PAGE電泳分析,得到純度很高的蛋白,Bradford法測蛋白濃度,收率為1.6mg/L發(fā)酵液；含表達(dá)質(zhì)粒pET28a-His-AS的包涵