中國(guó)甜柿自然脫澀相關(guān)基因ADH和PDC的分離及功能驗(yàn)證.pdf

1、中國(guó)原產(chǎn)完全甜柿(簡(jiǎn)稱“中國(guó)甜柿”或CPCNA)自然脫澀性狀受顯性基因控制，而日本原產(chǎn)完全甜柿(簡(jiǎn)稱“日本甜柿”或JPCNA)受隱性基因控制，因而中國(guó)甜柿較日本甜柿具有更重要的育種價(jià)值。中國(guó)甜柿自然脫澀機(jī)理明顯有別于僅依靠“稀釋效應(yīng)”的日本甜柿，除“稀釋效應(yīng)”外可能還涉及單寧的“凝固效應(yīng)”，即可溶性單寧與乙醛反應(yīng)轉(zhuǎn)變成不溶性單寧的過(guò)程。本研究以中國(guó)甜柿為試材，以非完全甜柿(non-PCNA)和日本甜柿為對(duì)照，首先從中國(guó)甜柿中分離參與乙醛

2、代謝的兩個(gè)關(guān)鍵酶基因:乙醇脫氫酶基因(ADH)和丙酮酸脫羧酶基因（PDC）;進(jìn)而通過(guò)分析其在不同脫澀類型（中國(guó)甜柿、日本甜柿和非完全甜柿）、不同發(fā)育階段（花后5、10、15、20和25周）、不同部位（花、葉片、萼片、果皮、果肉、果心和種子）表達(dá)模式差異并結(jié)合單寧含量及乙醇和乙醛含量分析，篩選與中國(guó)甜柿可溶性單寧的自然凝固直接有關(guān)的目標(biāo)基因;此外，通過(guò)構(gòu)建瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，進(jìn)一步確認(rèn)候選目標(biāo)基因的功能，以期從分子水平解析中國(guó)甜柿自然脫澀機(jī)理。

3、
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.以GFP作為報(bào)告基因，基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射滲透法，建立適宜栽培柿基因功能驗(yàn)證的活體葉片瞬時(shí)超表達(dá)體系。通過(guò)乙酰丁香酮濃度、菌液濃度和注射后不同采樣時(shí)間對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，且該體系適用于不同脫澀類型柿品種‘磨盤柿’(non-PCNA)、‘鄂柿1號(hào)’(CPCNA)和‘寶蓋甜柿’(CPCNA)。將DkLAC1瞬時(shí)轉(zhuǎn)化‘磨盤柿’和‘鄂柿1號(hào)’葉片，發(fā)現(xiàn)DkLAC1表達(dá)導(dǎo)致兩個(gè)柿品種葉片原花青素

4、含量升高。
　　2.基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射滲透法，建立ihpRNA(發(fā)夾RNA)誘導(dǎo)的柿活體葉片基因瞬時(shí)沉默技術(shù)。DkPDS被選擇作為內(nèi)源報(bào)告基因，用于評(píng)價(jià)該瞬時(shí)沉默體系。利用該技術(shù)將pHG-LAR(DkLAR基因ihpRNA干涉載體)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化‘磨盤柿’、‘鄂柿1號(hào)’和‘陽(yáng)豐’活體葉片，利用DMACA染色及Folin-Ciocalteau法測(cè)定原花青素含量，結(jié)果顯示DkLAR瞬時(shí)沉默均導(dǎo)致柿葉片原花青素含量顯著降低，表明DkLAR參

5、與柿原花青素的生物合成。
　　3.基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法，建立柿組培苗瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系。在真空滲透20min條件下GUS基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高。利用該技術(shù)將pHG-LAR(DkLAR基因ihpRNA干涉載體)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化‘小果甜柿’和‘磨盤柿’組培苗，利用DMACA染色及Folin-Ciocalteau法測(cè)定原花青素含量，結(jié)果顯示DkLAR瞬時(shí)沉默導(dǎo)致兩個(gè)柿品種組培苗葉片原花青素含量顯著降低。進(jìn)一步證實(shí)DkLAR在柿原花青素生物合成中具

6、有重要的作用。
　　4.中國(guó)甜柿可溶性單寧累積持續(xù)到果實(shí)發(fā)育后期。在花后20-25周(WAF)，其可溶性單寧含量迅速降低并完成自然脫澀過(guò)程，且不溶性單寧含量在果實(shí)發(fā)育后期(15-25 WAF)快速上升，表明中國(guó)甜柿自然脫澀可能涉及可溶性單寧的凝固。非完全甜柿果實(shí)直至成熟期其可溶性單寧含量仍維持較高水平。日本甜柿在果實(shí)早期（10WAF前）停止可溶性單寧的累積，并通過(guò)“稀釋效應(yīng)”完成自然脫澀過(guò)程。
　　5.從中國(guó)甜柿中分離3個(gè)A

7、DH基因家族成員（DkADH1、DkADH2和DkADH3）和4個(gè)PDC基因家族成員（DkPDC1、DkPDC2、DkPDC3和DkPDC4）。其中DkADH1、DkADH2、DkADH3、DkPDC2和DkPDC3均獲得cDNA全長(zhǎng)序列，其ORF序列分別為1140bp、1137bp、1044 bp、1824 bp和1743 bp。
　　6.ADH和PDC時(shí)空表達(dá)分析結(jié)果顯示，在中國(guó)甜柿果實(shí)發(fā)育后期，即不溶性單寧含量快速上升期間(

8、15-25 WAF)，DkADH1、DkPDC1和DkPDC2特異性上調(diào)表達(dá);且在種子中ADH和PDC高量表達(dá)，尤其是DkADH1、DkPDC1和DkPDC2。這表明DkADH1、DkPDC1和DkPDC2可能與中國(guó)甜柿單寧凝固具有密切的關(guān)系。
　　7.不同發(fā)育時(shí)期果肉和種子乙醇和乙醛含量測(cè)定的結(jié)果表明，種子中乙醇和乙醛含量均高于果肉。中國(guó)甜柿和日本甜柿種子乙醛含量隨果實(shí)發(fā)育不斷升高，乙醇含量在果實(shí)發(fā)育早期較高，而后隨果實(shí)發(fā)育不斷

9、降低。尤其在果實(shí)發(fā)育后期(20-25WAF)，中國(guó)甜柿種子乙醛含量快速上升，與其不溶性單寧含量變化趨勢(shì)一致。果肉中乙醇含量均隨果實(shí)發(fā)育而不斷降低。中國(guó)甜柿和非完全甜柿果肉乙醛含量也隨果實(shí)發(fā)育不斷降低，而日本甜柿與之相反。
　　8.采用‘磨盤柿’葉片的瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，DkADH1和DkPDC2超表達(dá)均能顯著降低葉片可溶性單寧含量。
　　綜上所述，基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射滲透和真空滲透法，本研究建立了柿活體葉片和組培苗的瞬