胸膜肺炎放線桿菌和豬瘟病毒的基因組測序與比較基因組學(xué)研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(PorcineContagiousPleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一種高度接觸傳染的呼吸道疾病。豬瘟(Swinefever,SF)，歐洲人稱為古典豬瘟(Classicalswinefever，CSF)，是由豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一種高度接觸性和致死性傳染病。這兩

2、種重要的病原微生物所引起的疾病已經(jīng)給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因組序列被測序完成，對基因組序列的比較分析為探索微生物的遺傳變異提供了一個嶄新的機(jī)會。我們利用生物信息學(xué)的分析方法和策略，對以上2種病原微生物的基因組序列進(jìn)行了深入地比較與分析，描述了基因組序列結(jié)構(gòu)與病原的致病能力/代謝機(jī)制之間的關(guān)系。主要的研究內(nèi)容包括： 1.APP的基因組測序與分析目前，APP根據(jù)表面脂多糖

3、和莢膜多糖的不同劃分成至少15個血清型，不同血清型菌株的毒力、抗原性和地域分布不盡相同。APP血清型的這些特點(diǎn)為發(fā)展安全有效的疫苗和簡易的診斷方法帶來了困難。 APP代謝和致病的分子機(jī)制一直以來都是獸醫(yī)界和診斷醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。但是APP基因組信息的缺乏已成為制約該細(xì)菌研究技術(shù)發(fā)展的瓶頸。因此，解析我國流行的優(yōu)勢血清3型APP的全基因組序列，不僅為國際APP基因組計劃提供了“參考序列”，而且為該病防治技術(shù)的研究提供了理論依據(jù)和研

4、究材料。 在本研究中，我們對一株在中國流行的優(yōu)勢血清3型APPJL03株進(jìn)行了基因組測序，并且首次對APP進(jìn)行了全面的功能注釋和分析比較。完成測序的JL03基因組由一個長度為2,242,062bp的染色體組成，一共預(yù)測出2097個蛋白質(zhì)的編碼序列，6個核糖體rRNA操縱子和63個tRNA基因(GenBank登陸號：CP000687)。另外，加拿大測序完成的APP血清5b型L20株的長度約為2.27Mbp，含有2012個CDS：而

5、部分測序的APP血清1型4074株序列包含140個連接群(contig)，長約2.07Mbp，含有2132個CDS。在三個已測序的APP菌株中，JL03株為低毒力株，L20和4074株均為強(qiáng)毒株。 通過APP三個菌株間以及APP與巴斯德菌科其他物種的比較基因組學(xué)的研究，詳細(xì)描述了APP的代謝機(jī)制和致病性/毒力的特征。確認(rèn)了APP代謝通路上的一系列基因，證實(shí)APP可以通過發(fā)酵和呼吸(有氧呼吸和無氧呼吸)兩種方式產(chǎn)生能量(ATP)，

6、并且為闡明這一復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)提供了一個全面的遺傳基礎(chǔ)。在JL03基因組中，鑒定出一些特征性的基因組島：同化硫還原基因串；F1p鞭毛合成基因串，參與細(xì)菌黏附作用；莢膜多糖合成基因串，參與細(xì)菌莢膜多糖的合成；脂多糖O抗原基因串，參與細(xì)菌O抗原的合成。同時，我們發(fā)現(xiàn)在L20株中存在一個37.7kb的基因組島，其上編碼了8個噬菌體相關(guān)基因，該島未在JL03株中發(fā)現(xiàn)。這些基因組島的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究APP血清多樣性的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。 另外，

7、我們描述了與細(xì)菌毒力相關(guān)的一整套基因，JL03株中的某些基因發(fā)生了遺傳上的丟失或者不同類型的突變。以上分析證實(shí)了以往對該病原毒力決定簇的認(rèn)識，為解釋不同血清型菌株之間毒力的差異提供了理論依據(jù)。 總之，APP基因組序列結(jié)構(gòu)的解析和編碼蛋白質(zhì)功能的初步分析不僅證實(shí)了該菌部分生理生化的表型特征，并且為探索這個重要病原菌的毒力和代謝的特征提供了新的研究設(shè)想。 2.CSFV的基因組測序與分析CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬，只有單一的

8、血清型，是一種單正鏈的RNA病毒。在本研究中，我們對一株分離自中國河南的CSFVSWH/CA/2004株進(jìn)行了基因組測序和分析比較。SWH/CA/2004基因組cDNA的序列長度為12296nt(GenBank登陸號：DQ127910)，5'NTR長度為373nt，3'NTR的長度為226nt以及一個開放讀碼框，編碼一個3898個氨基酸的聚蛋白前體。對SWH/CA/2004株與其它已報道的CSFV株進(jìn)行基因組的序列比對和進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn)：

9、不同株基因組的核苷酸的相似性在92.4％-97.9％之間，氨基酸的相似性在96.1％-98.4％之間。SWH/CA/2004與中國強(qiáng)毒株cF114/CA/2001株的遺傳距離最接近，為0.013；而與中等毒力的GXWZ02/CA/2003株的遺傳距離較遠(yuǎn)，為0.170。 我們?nèi)胬煤头治隽爽F(xiàn)有的不同地區(qū)來源的豬瘟病毒全長基因組的序列信息，揭示出CSFV的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，為研究豬瘟病毒的遺傳變異和分子流行病學(xué)提供了參考材料和研究基

10、礎(chǔ)。 3.黃病毒科RNA聚合酶表達(dá)抑制的研究黃病毒科的依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRp)參與組成病毒的復(fù)制酶復(fù)合體，在病毒的復(fù)制循環(huán)中發(fā)揮重要的作用。在本研究中，針對三種病毒的RNA聚合酶基因高度保守的MotifV區(qū)域設(shè)計了相應(yīng)的小干擾RNA分子(smallinterferingRNA，siRNA)，用來研究siRNA分子在調(diào)控RNA聚合酶表達(dá)過程中的作用。 我們