TGF-β-,1-對(duì)奶牛乳腺細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)理研究.pdf

1、本研究目的在于揭示TGF-B1對(duì)奶牛乳腺細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)理，以闡明TGF-B1與奶牛退化期乳腺細(xì)胞凋亡的關(guān)系.實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建奶牛乳腺組織培養(yǎng)體系，對(duì)組織、細(xì)胞進(jìn)行TGF-B1處理，研究TGF-B1對(duì)乳腺細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)理。 1、奶牛乳腺組織體外培養(yǎng)方法的建立 采用組織灌流和組織塊貼壁法體外培養(yǎng)奶牛乳腺組織，通過LDH活力測(cè)定，臺(tái)盼蘭染色、瓊脂糖凝膠電泳、透射電鏡技術(shù)比較兩種培養(yǎng)方法對(duì)奶牛乳腺組織活性及組織超微結(jié)構(gòu)

2、的影響，建立奶牛乳腺組織的培養(yǎng)體系，結(jié)果表明：以1mL/h的速度灌流培養(yǎng)的奶牛乳腺組織在DMEM+10％小牛血清培養(yǎng)基中24～72h內(nèi)保持良好的組織活性和超微結(jié)構(gòu)，貼壁培養(yǎng)的奶牛乳腺組織在DMEM+10％小牛血清的培養(yǎng)基中48～108h內(nèi)保持良好的組織活性和超微結(jié)構(gòu)，兩種培養(yǎng)方法各有優(yōu)缺點(diǎn). 2、TGF-B1對(duì)奶牛乳腺組織活性、凋亡及HSP70蛋白表達(dá)的影響 應(yīng)用LDH活力測(cè)定、瓊脂糖凝膠電泳、透射電鏡、免疫組化和Cas

3、pase-3活性分析等技術(shù)，檢測(cè)TGF-B1對(duì)奶牛乳腺組織活性、凋亡和HSP70蛋白表達(dá)的影響.結(jié)果表明：隨TGF-B1作用時(shí)間的延長(zhǎng)(1)組織細(xì)胞的活率逐漸降低，12h、24h和48h組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；LDH活力逐漸升高，6h、12h、24h和48h組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；(2)12、24、48h組DNA發(fā)生斷裂；Caspase-3活性24h達(dá)到高峰，并顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；上皮細(xì)胞逐漸由腺泡脫落

4、、腺泡塌陷，但間質(zhì)結(jié)構(gòu)基本完整；超微結(jié)構(gòu)顯示48h上皮細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)凝集、線粒體腫脹等明顯凋亡特征，而成纖維細(xì)胞細(xì)胞致密、線粒體豐富，結(jié)構(gòu)較完整；(3)3～12h組織過表達(dá)HSP70，且均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論：TGF-B1誘導(dǎo)奶牛乳腺組織的上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，并誘導(dǎo)組織過表達(dá)HSP70。結(jié)果提示，TGF-B1可以以促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡的方式，促進(jìn)奶牛乳腺發(fā)生退化。 3、TGF-B1對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡及HSP7

5、0蛋白表達(dá)的影響 應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、LDH活力測(cè)定、瓊脂糖凝膠電泳、Westernbolt技術(shù)，檢測(cè)TGF-B1對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡率、LDH活力、DNA完整性及HSP70的表達(dá).結(jié)果表明：1、5、10ng/mL的TGF-B1均能抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖，且隨濃度增加抑制作用加大，呈現(xiàn)劑量依賴性，其中10ng/mLTGF-B1組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；10ng/mLTGF-B1作用于乳腺上皮細(xì)胞24h，隨作用時(shí)

6、間延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡率逐漸增加，6h、12h和24h組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；LDH活力也不斷升高，6h、12h和24h組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；DNA隨TGF-B1作用時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生不同程度降解；TGF-B1作用2h～6h細(xì)胞大量表達(dá)HSP70，6h達(dá)到高峰，而后下降，2～12h的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05).結(jié)論：TGF-B1可以抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，具有濃度依賴性。10ng/mLTGF-B1可以

7、顯著增加細(xì)胞凋亡率，提高細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力，使細(xì)胞DNA發(fā)生不同程度的降解，同時(shí)HSP70蛋白隨TGF-B1作用時(shí)間發(fā)生顯著的表達(dá)變化。 4、TGF-B1誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的信號(hào)機(jī)制 應(yīng)用MIT、流式細(xì)胞術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳、Westembolt、免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)TGF-B1及SB-431542對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡、DNA完整性、p-Smad2/3的表達(dá)的影響，結(jié)果表明：TGF-B1作用于奶牛乳腺上皮細(xì)

8、胞，0.5～2h內(nèi)激活Smad2/3發(fā)生磷酸化，且入核傳導(dǎo)信號(hào)，接著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i升高，激活Caspase-3，裂解DNA，從而細(xì)胞發(fā)生了凋亡.10-2umol/LSB-431542通過抑制ALK-5的激酶活性阻滯了TGF-B1的信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)了TGF-B1對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的抗增殖和促凋亡作用.這些結(jié)果表明：TGF-B1通過ALK-5-Smad2/3路徑誘導(dǎo)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡，且TGF-B1誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞凋亡依賴于細(xì)胞內(nèi)