用于改善生物大分子藥物功效的超多孔水凝膠、納米粒新型給藥載體.pdf

1、隨著科學技術的迅猛發(fā)展,以往單一學科及其技術難以解決的關鍵科學問題經(jīng)多學科交叉及技術的使用獲得突破。本文運用生物科學、材料科學、納米科學及藥劑學等學科的理論和方法,研究可顯著改善蛋白質(zhì)多肽類藥物及DNA、siRNA功效的新型給藥載體及其作用機理。
　　蛋白質(zhì)多肽、核酸等生物大分子藥物藥理活性強、特異性高,在腫瘤、糖尿病、感染性疾病等重大疾病的治療中顯示出巨大潛力,但其臨床應用主要為注射劑型,多數(shù)藥物半衰期短,長期用藥患者順應性差。

2、而非注射給藥特別是口服給藥時,此類親水性生物大分子藥物不易被親脂性的生物膜攝取,易被體內(nèi)各種酶降解導致活性降低或失活,生物利用度低。利用給藥系統(tǒng)(DrugDeliverySystem,DDS)可提高生物大分子藥物的體內(nèi)外穩(wěn)定性、促進藥物吸收、改善藥物體內(nèi)作用功效。其中水凝膠給藥載體還可控制藥物釋放,具有生物黏附、生物相容和生物可降解等特性;納米給藥載體還可增溶難溶性藥物,緩控釋藥物和靶向給藥。
　　同時具有抑制蛋白酶活性、促進藥物

3、滲透及黏膜黏附等性質(zhì)的多功能聚合物給藥載體可顯著提高蛋白質(zhì)多肽類藥物的口服吸收,能有效突破胞外屏障(吞噬系統(tǒng)、核酸酶)和胞內(nèi)屏障(細胞膜、內(nèi)涵體、溶酶體、核膜)的多功能非病毒基因載體有望持續(xù)、高效地將基因?qū)氚屑毎桶薪M織。據(jù)此,設計并研究新型互穿網(wǎng)絡聚合物超多孔水凝膠(SPH-IPN),以胰島素為模型藥物,研究SPH-IPN促進蛋白質(zhì)多肽類藥物的口服吸收及作用機理:依據(jù)殼聚糖季胺鹽(TMC)與巰基化聚合物黏膜黏附及促滲特點,設計一種新

4、型殼聚糖多功能衍生物-巰基化殼聚糖季胺鹽(TMC-Cys),以胰島素和pEGFP分別作為模型蛋白質(zhì)藥物和模型基因,研究其自組裝納米載體促進蛋白質(zhì)藥物口服吸收、基因轉(zhuǎn)染及其作用機理:對TMC-Cys納米載體進行甘露糖配體修飾,以TNF-αsiRNA為靶基因,研究甘露糖修飾的TMC-Cys(MTC)納米載體對小腸M細胞、巨噬細胞的主動靶向作用及增加siRNA口服給藥功效與作用機理。
　　1.SPH-IPN的制備和表征
　　以丙烯

5、酸(AA)和丙烯酰胺(AM)為單體,過硫酸銨(APS)/N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)為引發(fā)體系,NaHCO3為起泡劑,N,N’-亞甲基-雙丙烯酰胺(Bis)為交聯(lián)劑,溶液聚合制得聚(丙烯酸-丙烯酰胺)(P(AA-co-AM))超多孔水凝膠;采用分步互穿網(wǎng)絡聚合物技術,聚合時加入O-羧甲基殼聚糖(O-CMC),膠凝后以戊二醛(GA)交聯(lián)O-CMC;制得SPH-IPN。傅立葉變換紅外光譜(FTIR)、核磁共振(13CNMR

6、)、差示掃描量熱分析(DSC)等研究表明SPH-IPN中含有P(AA-co-AM)和交聯(lián)的O-CMC;掃描電鏡(SEM)、光鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)觀察表明SPH-IPN含有大量相互連接、直徑100-300μm的孔隙,O-CMC圍繞孔隙邊緣分布。SPH-IPN孔隙率大于80％,水中可快速溶脹,平衡溶脹比30-80,SPH-IPN的溶脹比隨O-CMC含量增加、交聯(lián)度增加、交聯(lián)時間延長而降低。引入互穿網(wǎng)絡聚合物(IPN)結(jié)構(gòu)可顯

7、著提高SPH-IPN的壓縮模量和拉伸模量;壓縮模量和拉伸模量均隨O-CMC含量增加而顯著提高:壓縮模量隨O-CMC交聯(lián)度增加、交聯(lián)時間延長而顯著提高。
　　2.SPH-IPN的刺激敏感性溶脹及載藥和釋藥特性
　　考察pH、離子強度和溫度對SPH-IPN溶脹行為的影響;以胰島素為模型藥物,研究SPH-IPN的載藥量、載胰島素SPH-IPN在不同介質(zhì)中的體外釋放行為、載藥前后胰島素的穩(wěn)定性及聚合物-藥物相互作用;研究SPH-IP

8、N中水的狀態(tài)及保水性。
　　研究表明,SPH-IPN的溶脹具有離子強度、pH和溫度敏感性。離子強度≥0.0lmol·L-1時,SPH-IPN的溶脹比隨離子強度增大而減小;離子強度≤0.001mol·L-1時,溶脹不受影響。pH≤3.0時SPI-IPN幾乎不溶脹;3.0≤pH≤6.2時隨pH升高溶脹速率加快,溶脹比增大;pH≥6.2時溶脹充分,溶脹行為無顯著改變;SPH-IPN對脈沖式pH改變可快速響應,呈現(xiàn)可逆的溶脹-去溶脹行為。

9、溫度升高可促進SPH-IPN的溶脹。SPH-IPN對胰島素吸附載藥的載藥量為4％-7％,顯著高于傳統(tǒng)超多孔水凝膠(CSPH);載藥量隨O-CMC含量增加而略有降低。胰島素體外釋放對離子強度、pH和溫度敏感。圓二色譜分析和生物活性檢測結(jié)果表明載藥前后胰島素的構(gòu)象和生物活性無顯著變化。SPH-IPN對胰島素的實際載藥率顯著高于理論載藥率,pH7.4PBS介質(zhì)中藥物可快速、完全釋放,空白SPH-IPN和釋藥后SPH-IPN的FTIR圖譜相似,

10、表明SPH-IPN與胰島素間存在較強的物理相互作用,不存在化學共價連接。溶脹的SPH-IPN中可凍結(jié)水占主要部分;SPH-IPN與水分子形成氫鍵的作用隨O-CMC含量和胰島素載藥量增加而減弱。外加壓力與37℃孵育時,SPH-IPN保水性較好,保水性隨O-CMC含量增加而提高。
　　3.SPH-IPN增加胰島素口服吸收及促吸收機理
　　考察載胰島素SPH-IPN正常大鼠口服給藥和回腸給藥的生物利用度,以及糖尿病模型大鼠口服給藥

11、降血糖效果;從黏膜黏附、蛋白酶抑制、滲透促進、小腸滯留等方面探討SPH-IPN促胰島素腸道吸收機理;考察聚合物結(jié)構(gòu)完整性對SPH-IPN抑酶、促滲、小腸滯留及胰島素口服吸收的影響。
　　正常大鼠口服載胰島素完整的SPH-IPN(I-SPH-IPN)后藥物吸收和降血糖效果顯著,血糖最低降至初始值的65％,相對皮下注射的口服生物利用度為5.0％,藥理生物利用度為6.3％;口服載胰島素粉碎的SPH-IPN(P-SPH-IPN)后藥物吸收

12、和降血糖效果均不明顯;回腸給予載胰島素I-SPH-IPN和P-SPH-IPN時,藥物吸收和降血糖效果顯著,血糖最低降至初始值的30％,二者效果相當,均優(yōu)于口服給藥;糖尿病模型大鼠口服載胰島素I-SPH-IPN后降血糖效果顯著。SPH-IPN可通過非特異性作用和機械作用黏附至小腸黏膜,黏附力隨O-CMC含量增加而增大。SPH-IPN可通過捕獲蛋白酶溶液和絡合Ca2+抑制腸腔蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶)活性,且SPH-IPN絡合二價金屬離子

13、的能力隨O-CMC含量增加而增強,抑酶作用相應增強。I-SPH-IPN和P-SPH-IPN的體外抑酶作用相當,I-SPH-IPN可減少藥物在腸腔中的釋放,增加黏液層和黏膜中的釋放,從而降低腸腔蛋白酶對藥物的降解,I-SPH-IPN對胰島素的保護作用強于P-SPH-IPN。SPH-IPN通過機械作用可逆打開小腸上皮細胞間緊密連接,促進胰島素的胞間轉(zhuǎn)運;加入I-SPH-IPN和P-SPH-IPN,Caco-2細胞單層的跨膜電阻最低分別降至初

14、始值的25％和50％,FITC-胰島素在Caco-2細胞單層中的轉(zhuǎn)運量分別提高至未加聚合物的4.9和1.9倍,離體小腸中的Papp分別提高至4.2和1.8倍,表明I-SPH-IPN打開上皮細胞間緊密連接和促胰島素滲透的能力強于P-SPH-IPN。I-SPH-IPN通過機械作用固定于大鼠小腸壁,小腸滯留時間超過8h;P-SPH-IPN在小腸中易分散,無法通過機械作用固定于腸壁,滯留時間短于4h。
　　4.SPH-IPN的生物相容性<

15、br>　　考察SPH-IPN的細胞毒性、基因(遺傳)毒性、小腸組織相容性、口服急性、亞急性毒性和血液相容性,從整體動物、組織、細胞和分子水平評價SPH-IPN的安全性;HPLC測定SPH-IPN中單體和交聯(lián)劑的殘留量,為生物相容性評價提供依據(jù)。
　　FDA／PI雙染色、LDH、中性紅、蛋白質(zhì)含量測定試驗結(jié)果表明RBL-2H3和Caco-2細胞與SPH-IPN及其浸提液(1O、1、0.1mg·mL-1)短時程(24h)接觸后,胞外L

16、DH釋放量、胞內(nèi)中性紅攝入量、蛋白質(zhì)含量均無顯著變化,細胞活力無顯著影響;MTT試驗結(jié)果表明二種細胞與SPH-IPN及其浸提液長時程(7d)接觸后,細胞增殖率無顯著影響,SPH-IPN細胞毒性低。DNALadder、流式細胞儀檢測、單細胞凝膠電泳和小鼠骨髓微核試驗結(jié)果表明SPH-IPN不會引起RBL-2H3和Caco-2細胞凋亡、DNA斷裂和小鼠骨髓微核發(fā)生,基因毒性低。SPH-IPN不會引起大鼠小腸黏膜組織損傷,組織相容性良好。SPH

17、-IPN浸提液小鼠灌胃給藥最大耐受劑量為1000mg·kg-1；亞急性毒性試驗中連續(xù)28天每天一次灌胃給予SPH-IPN浸提液(500、200、100mg.kg-1),小鼠體重增長正常,血液學和血清生化指標正常,肝、腎、脾重量正常,組織切片中未見炎癥、壞死、水腫等病理現(xiàn)象,肝、腎、脾中ACP、ALKP、GPT、GOT和LPO含量正常,表明SPH-IPN口服安全性好。SPH-IPN的溶血率低于5％,動態(tài)凝血率低于硅化玻璃,血小板黏附率低,

18、具有一定的抗凝血效果,血液相容性良好。SPH-IPN中AA、AM和GA的殘留量分別為1.4±0.6、2.0±0.2、<0.2ppm,符合其限量規(guī)定。
　　5.巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒增加胰島素口服吸收及其作用機理
　　殼聚糖經(jīng)季胺化和巰基化修飾制備TMC-Cys,表征理化性質(zhì);聚電解質(zhì)(PEC)法制備TMC-Cys／胰島素自組裝納米粒(TMC-CysNP)并表征理化性質(zhì);考察TMC-CysNP正常大鼠口服給藥和回腸給藥

19、的降血糖效果,研究TMC-CysNP促胰島素口服吸收機理。
　　殼聚糖(Mw30、200、500kDa)與碘甲烷反應合成季胺化度分別為15％和30％的TMC,TMC與Cys經(jīng)EDAC／NHS催化的縮合反應合成FMC-Cys。400-500μmol·g-1Cys共價連接至TMC,其中約35％為游離巰基,其余為二硫鍵;游離巰基在中性條件下可氧化形成二硫鍵。FTIR和13CNMR表明TMC與Cys以酰胺鍵連接,DSC和TGA結(jié)果表明季胺

20、化和巰基化修飾可改變殼聚糖的結(jié)晶度,降低其熱穩(wěn)定性。TMC-Cys的抑菌作用與TMC相近,清除自由基作用強于TMC,季胺化度較高時抑菌作用較強,清除自由基能力減弱。荷正電的TMC-Cys與荷負電的胰島素經(jīng)靜電作用自組裝形成TMC-CysNP,納米粒呈球形,分散度良好,粒徑為100-170nm,Zeta電勢為+12-+18mV,胰島素包封率達90％。納米粒粒徑、Zeta電勢和包封率受胰島素溶液pH、TMC-Cys／胰島素質(zhì)量比和離子強度影

21、響;胰島素體外釋放受殼聚糖分子量、季胺化度、釋放介質(zhì)離子強度和離子類型影響。TMC-CysNP的小腸黏膜黏附力和黏蛋白黏附率較TMCNP分別提高2.1-4.7倍和1.5-2.2倍,黏蛋白黏附率隨殼聚糖分子量或季胺化度升高而增加。DSC分析表明TMC-Cys通過與黏蛋白間形成二硫鍵提高黏附力。與TMCNP相比,TMC-CysNP胰島素的離體小腸Papp提高1.7-2.6倍,Caco-2細胞攝取量提高1.7-3.0倍,Peyer’s結(jié)攝取量

22、提高1.7-5.0倍,其中TMC-Cys(200,30)NP的促滲作用最強。大鼠口服和回腸給藥時,TMC-CysNP的降血糖效果優(yōu)于TMCNP,血糖最低分別降至初始值的65％和30％。Caco-2細胞MTT試驗和大鼠回腸LDH試驗結(jié)果表明TMC-CysNP細胞毒性低,安全性良好。
　　6.巰基化殼聚糖季胺鹽納米載體增加基因轉(zhuǎn)染效率及其作用機理
　　以增強型綠熒光蛋白表達質(zhì)粒(pEGFP)為模式質(zhì)粒,PEC法制備TMC-Cys

23、/pEGFP自組裝納米復合物(TMC-CysNC)并表征理化性質(zhì);考察TMC-CysNC在HEK293細胞和小鼠脛前肌中的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率,研究其轉(zhuǎn)染機制。
　　TMC-CysNC呈球形,分散度良好,粒徑為150-400nm,Zeta電勢為+14-+20mV;凝膠阻滯試驗結(jié)果表明TMC-Cys可通過靜電作用縮合pDNA;TMC-CysNC可有效保護pDNA免受核酶降解。TMC-CysNC的細胞黏附率較TMCNC顯著提高;TMC-Cy

24、sNC的HEK293細胞攝取率分別提高至TMCNC和Lipofectamine2000的1.4-3.0倍和1.6-4.4倍;4℃時TMC-CysNC的攝取量為37℃時的25％,疊氮鈉和氯丙嗪處理分別使攝取量減少40％和70％,表明TMC-CysNC主要經(jīng)能量依賴的網(wǎng)格蛋白介導的細胞內(nèi)吞途徑進胞;松胞素D和染料木素對TMC-CysNC的攝取無顯著影響,表明進胞機理與細胞骨架的重構(gòu)和窖蛋白介導的通路無關。TMC-CysNC的釋放行為呈現(xiàn)谷胱

25、甘肽(GSH)濃度依賴性,胞外GSH濃度下緩慢釋放pEGFP,胞內(nèi)GSH濃度下快速釋放pEGFP并轉(zhuǎn)運進核,細胞核中pEGFP的含量為TMCNC組的3.7倍。TMC-CysNC在HEK293細胞中的轉(zhuǎn)染效率提高至TMCNC的1.4-3.2倍,其中TMC-Cys(100,30)NC的轉(zhuǎn)染效率最高(約35％),為Lipofectamine2000的1.5倍。TMC-Cys(100.30)NC的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率分別提高至TMCNC和Lipofec

26、tamine2000的2.3倍和4.1倍。
　　7.靶向M細胞、巨噬細胞的MTC納米載體增加siRNA口服給藥功效及其作用機理
　　制備MTC及其納米粒,研究納米粒的理化性質(zhì);以TNF-αsiRNA為靶基因,研究MTC納米粒對小腸M細胞、巨噬細胞的主動靶向作用和提高siRNA口服給藥功效及其作用機理。
　　TMC(200、500kDa)經(jīng)甘露糖修飾和巰基化修飾制得甘露糖修飾度約20％的MTC:捕獲法、吸附法和自組裝法分

27、別制各載siRNAMTC納米粒(en-MTC-TPPNP、ad-MTC-TPPNP和MTC-SANP),納米粒為球形或亞球形,分散良好,粒徑為130-230nm,Zeta電勢為正值,siRNA包封率為70-80％,納米?？娠@著提高siRNA的血清穩(wěn)定性:納米粒粒徑隨殼聚糖分子量增大而增大;ad-MTC-TPPNP和MTC-SANP受離子強度影響較大,siRNA包封率隨離子強度升高而顯著降低,但en-MTC-TPPNP受離子強度影響較小。

28、與載NCsiRNA的巰基化殼聚糖季胺鹽納米粒(en-TC-TPPNP)相比,en-MTC-TPPNP的Caco-2細胞和Raw264.7細胞黏附力顯著提高,siRNA在Raw264.7細胞中的攝取量提高2.0-2.4倍,Peyer’S結(jié)攝取量提高1.9-2.4倍,體外M細胞模型和Caco-2細胞單層轉(zhuǎn)運量提高1.2-2.1倍,離體小腸轉(zhuǎn)運量提高6.9-11.0倍,且M細胞模型中的轉(zhuǎn)運量顯著高于Caco-2細胞單層中的轉(zhuǎn)運量,含Peyer

29、’s結(jié)離體小腸的轉(zhuǎn)運量高于不含Peyer’s結(jié)離體小腸的轉(zhuǎn)運量,表明甘露糖配體修飾載體可通過特異性配體-受體結(jié)合作用顯著提高納米粒對M細胞和巨噬細胞的主動靶向作用,從而促進siRNA的小腸攝取和轉(zhuǎn)運。以TNF-αsiRNA為靶基因,en-MTC-TPPNP在Raw264.7細胞中的干擾效率顯著強于en-TC-TPPNP和Lipofectamine2000;相同干擾效率(70％)時,en-MTC-TPPNP的siRNA劑量較Lipofec