豬熱激蛋白Gp96N端基因與豬瘟病毒E2基因重組表達(dá)及重組蛋白的免疫原性研究.pdf

1、豬瘟病毒E2蛋白是豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)的囊膜糖蛋白，可誘導(dǎo)動(dòng)物體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，是研究新型疫苗的主要對(duì)象。有研究表明，Gp96N端結(jié)構(gòu)區(qū)的構(gòu)象有α螺旋溝，該區(qū)域與抗原肽結(jié)合能力強(qiáng)，形成的Gp96-抗原肽復(fù)合物非常穩(wěn)定，有潛在的免疫佐劑作用。
　　本研究將Gp96N(26AA-374AA)基因與E2全長(zhǎng)基因通過(guò)口蹄疫病毒(Foot and MouthDisease Viru

2、s，F(xiàn)MDV)2A基因進(jìn)行融合，然后分別采用真核和原核系統(tǒng)對(duì)該重組基因進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)原核表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行免疫原性的測(cè)定以探究Gp96N（26AA-374AA）蛋白與佐劑效果。
　　首先，將甲病毒復(fù)制子載體pSFV1進(jìn)行改造，加入真核CMV啟動(dòng)子和終止區(qū)SV40polyA序列，獲得一新的表達(dá)載體pSCA，然后將EGFP基因、豬瘟病毒E2全長(zhǎng)基因及Gp96N端與豬瘟病E2基因的融合片段分別克隆入pSCA載體中，獲得pSCA-EGFP

3、、pSCA-E2和pSCA-GE。轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pSCA-EGFP質(zhì)粒能夠得到有效表達(dá)，pSCA-E2、pSCA-GE能夠得到表達(dá)，但是pSCA-E2、pSCA-GE質(zhì)粒表達(dá)效率不高和平均熒光值偏低。
　　其次，將E2基因與串聯(lián)重組蛋白GE基因分別克隆入原核表達(dá)載體pET-32a(+)中得到重組質(zhì)粒pET-E2和pET-GE，轉(zhuǎn)化入Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，分別誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白E2和GE，隨

4、后對(duì)重組蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化摸索最佳表達(dá)條件，并通過(guò)梯度尿素法對(duì)重組蛋白進(jìn)行粗純化和復(fù)性;采用SDS-PAGE和Western Blotting實(shí)驗(yàn)對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白為能與抗體特異性反應(yīng)的目的蛋白。
　　最后，為了研究重組蛋白E2、GE在動(dòng)物體內(nèi)的免疫原性，將原核表達(dá)的重組蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗以及PBS通過(guò)皮下注射免疫小鼠。通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫鼠血清中豬瘟病毒E2蛋白的抗體水平，結(jié)果表明:重組