胎盤HLAⅠ類分子表達(dá)格局與母胎免疫耐受作用的研究初探.pdf

1、該課題從以下四方面對(duì)"胎盤HLA-G、C和E的分布格局在母胎免疫耐受中的作用"進(jìn)行初步探究.第一部分正常和難免流產(chǎn)婦女早孕蛻膜免疫效應(yīng)細(xì)胞分布格局采集20例正常早孕和8例難免流產(chǎn)婦女的蛻膜和絨膜組織,檢測(cè)了生理和病理情況下蛻膜組織中NK、NKT、Mφ、T細(xì)胞各亞型和IFN-γ(Th1型)和IL-4(Th2型)細(xì)胞因子的產(chǎn)生細(xì)胞的分布頻率;以及絨膜和蛻膜組織細(xì)胞凋亡和增殖的狀態(tài).此次實(shí)驗(yàn)采用CD3<'+>設(shè)門,主要檢測(cè)了產(chǎn)生IFN-γ和I

2、L-4的來(lái)源于CD3<'+>的T細(xì)胞和NKT細(xì)胞群體的數(shù)量,從細(xì)胞因子生成時(shí)間較早及CD56-CD3<'+>T細(xì)胞數(shù)目在兩組變化不大,而CD56<'->CD3<'+>NKT細(xì)胞變化顯著來(lái)看,在懷孕早期,產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的CD3<'+>細(xì)胞主要是NKT細(xì)胞.結(jié)果顯示,在正常人早孕成熟NKT細(xì)胞(IFN-γ生成細(xì)胞)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),而在難免流產(chǎn)早孕組,以不成熟NKT細(xì)胞(IL-4生成細(xì)胞)占主導(dǎo).此外,正常妊娠的絨毛和蛻膜組織中都存在細(xì)

3、胞凋亡,滋養(yǎng)層細(xì)胞大量凋亡與自然流產(chǎn)有著密切的關(guān)系.絨毛細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)也同樣表明自然流產(chǎn)組S/G2增殖期細(xì)胞數(shù)目少于正常組(P<0.05),提示正常早孕婦女的絨膜表現(xiàn)出增殖活性高于難免流產(chǎn)絨毛.第二部分正常和難免流產(chǎn)婦女KIR基因型和NK細(xì)胞同種反應(yīng)性分析滋養(yǎng)層細(xì)胞表面父系HLA-C的存在,以及不同婦女蛻膜NK細(xì)胞受體的異質(zhì)性,使得"NK細(xì)胞同種反應(yīng)性"在母胎界面的作用不容忽視.在正常組,KIR單倍型A占優(yōu)勢(shì),對(duì)妊娠有利,而以多種活化性K

4、IR基因組合為特征的單倍型B在難免流產(chǎn)組占優(yōu)勢(shì),不利于妊娠.第三部分HLA-C和HLA-G雙表達(dá)載體的克隆及在LcL721.221細(xì)胞的表達(dá)為模擬母胎界面HLAⅠ類抗原的分布格局,以及探討這種格局在母胎免疫耐受中的作用,我們用RT-PCR從孕婦絨毛膜組織有核細(xì)胞總mRNA中逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增全長(zhǎng)HLA-C和HLA-G cDNA,首先將HLA-G經(jīng)BamHⅠ和C1aⅠ雙酶切,HLA-C經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后,分別定向插入真核細(xì)胞雙順?lè)醋虞d

5、體pVITR02的多克隆位點(diǎn)1(mcsl)和2(mcs2)中,然后經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定,確定已建立pVITR02的單表達(dá)質(zhì)粒pVITR02-HLA-G和pVITR02-HLA-C,再將HLA-C cDNA經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切,定向插入單表達(dá)質(zhì)粒pVITR02-HLA-G的多克隆位點(diǎn)2(mcs2)中,經(jīng)PCR反應(yīng)初篩,再經(jīng)限制性內(nèi)切酶和測(cè)序分析表明已成功構(gòu)建了HLA-Cw*0103和HLA-G*0101的單表達(dá)質(zhì)粒pVITR02-HL

6、A-C和pVITR02-HLA-G以及雙表達(dá)質(zhì)粒pVITR02-HLA-CG.第四部分胎盤HLA-G、c和E的表達(dá)格局對(duì)子宮蛻膜效應(yīng)細(xì)胞功能的影響采用正常早孕和難免流產(chǎn)婦女蛻膜未分選的全部蛻膜細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,與第三部分構(gòu)建的LcL721.221-HLA-G*0101(HLA-G*0101和HLA-E共表達(dá))細(xì)胞、LcL721.221-HLA-C*0103(HLA-C*0103和HLA-E共表達(dá))細(xì)胞、LcL721.221-HLA-G*