細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建含融合自殺基因CDglyTK的重組腺病毒.pdf

1、該研究首先從質(zhì)粒pBlueScript-CD中PCR擴(kuò)增出帶有酶切識(shí)別位點(diǎn)的EC-CD基因片段,利用PCR產(chǎn)物兩末端帶有的單個(gè)A堿基,與帶有單個(gè)T堿基末端的PMD1 8-T載體借助堿基互補(bǔ)相連接,構(gòu)建成質(zhì)粒PMD1 8-T-CD.從該質(zhì)粒中切下EC-CD片段,與帶有相同粘性末端的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV構(gòu)建成pAdTrack-CMV-CD,并進(jìn)行了PCR和酶切鑒定.HSV-TK基因自質(zhì)粒pAdE1CMV-TK中經(jīng)PCR擴(kuò)增獲取,

2、并通過(guò)設(shè)計(jì)引物使之5'端帶有編碼甘氨酸的寡核苷酸鏈,最終獲得glyTK.glyTK基因和質(zhì)粒pAdTrack-CMV-CD經(jīng)酶切、連接構(gòu)建成含融合自殺基因的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-CDglyTK,并采用PCR擴(kuò)增、酶切以及對(duì)插入片斷進(jìn)行測(cè)序這三種方法進(jìn)行鑒定.重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建采用了細(xì)菌內(nèi)同源重組法,將經(jīng)Pme Ⅰ酶切線(xiàn)性化的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-CDglyTK和帶有腺病毒主要基因組的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共

3、同轉(zhuǎn)化至具有高同源重組能力的BJ51 83菌中,構(gòu)建成重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-GFP-CDglyTK.經(jīng)卡那霉素初篩、酶切和PCR鑒定正確后,再將其轉(zhuǎn)化至DH5α菌中,以獲取足量拷貝的重組質(zhì)粒.用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,包裝、擴(kuò)增出含融合自殺基因的重組腺病毒rAd-CDglyTK,從而為進(jìn)一步用于惡性腫瘤基因治療的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究以及最終的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).另外,在構(gòu)建重組腺病毒rAd-CDglyTK時(shí),該研究從方法學(xué)