Benzonase酶對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜的影響.pdf

1、目的:
　　1、分析金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌臨床分離株的生物膜形成能力。
　　2、研究Benzonase酶對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜的作用。
　　3、研究抗菌藥物與Benzonase酶聯(lián)合作用對生物膜內(nèi)活菌數(shù)量的影響。
　　方法:
　　1、剛果紅瓊脂(CRA)試驗和黏附試驗檢測金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生物膜形成能力，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測生物膜形成相關(guān)基因icaA。
　　2、

2、離心柱吸附法提取金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜內(nèi)的胞外DNA(eDNA)，Benzonase酶消化后瓊脂糖凝膠電泳觀察。
　　3、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌用胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后形成的生物膜，用含不同濃度Benzonase酶的TSB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h分別進行如下處理:甲醇固定，結(jié)晶紫染色，冰醋酸溶解后檢測其570nm處的吸光度值(OD570);平板菌落計數(shù)法檢測生物膜內(nèi)的活菌數(shù);甲醇固定，結(jié)晶紫染色

3、，光學(xué)顯微鏡下觀察;干燥固定，噴金后掃描電鏡下觀察。
　　4、微量肉湯稀釋法檢測金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌對10種抗菌藥物的敏感性，選取其中3種敏感的抗菌藥物分別與Benzonase酶聯(lián)合作用于菌株形成的生物膜，平板菌落計數(shù)法檢測生物膜內(nèi)的活菌數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1、收集的29株金黃色葡萄球菌和23株表皮葡萄球菌臨床分離株中，其中CRA試驗陽性的菌株分別為19株和17株，黏附試驗陽性的菌株也分別為19株和17株;P

4、CR擴增檢測icaA基因，金黃色葡萄球菌中有18株陽性，表皮葡萄球菌中有17株陽性。
　　2、提取金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的eDNA，瓊脂糖凝膠電泳分離后可見一條約15kb大小的條帶;用Benzonase酶消化eDNA后，凝膠電泳未見條帶。
　　3、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后形成的生物膜，分別用不同濃度Benzonase酶的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，其生物膜的含量和生物膜內(nèi)的活菌數(shù)隨著Benzo

5、nase酶濃度的升高而降低。當(dāng)Benzonase酶的濃度分別超過0.2U/ml和0.02U/ml時，金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜的OD570值和生物膜內(nèi)的活菌數(shù)下降不再發(fā)生變化。光鏡和掃描電鏡下觀察不同濃度Benzonase酶處理的生物膜，其形態(tài)發(fā)生明顯變化。
　　4、慶大霉素、利福平、萬古霉素分別與Benzonase酶聯(lián)合作用金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌培養(yǎng)24h形成的生物膜，其生物膜內(nèi)的活菌數(shù)下降程度比抗菌藥物單獨應(yīng)用時

6、明顯(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、從感染患者體液標(biāo)本和分泌物標(biāo)本中分離得到的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中存在高比例的生物膜形成陽性菌株。
　　2、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜中的eDNA通過DNA離心吸附柱方法分離得到的大小為15kb左右。
　　3、極微量濃度的Benzonase酶就能將生物膜中的eDNA降解，破壞生物膜的穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，使生物膜的含量和生物膜內(nèi)的活菌數(shù)大幅下降。
　　4、抗菌