一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜影響的研究.pdf

1、一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物體內(nèi)重要的活性分子。NO參與了生物體內(nèi)細(xì)胞的分化和凋亡、血管松弛、神經(jīng)傳遞、免疫防御反應(yīng)以及種子萌發(fā)、下胚軸伸長(zhǎng)、葉擴(kuò)展、根生長(zhǎng)等許多重要生理過(guò)程，被認(rèn)為是多功能的第二信使。NO在動(dòng)物體和高等植物中的研究早已受到廣泛的重視，但是NO在細(xì)菌中，尤其是在細(xì)菌形成的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)一細(xì)菌生物膜(biofilm)中的作用卻極少有人研究。細(xì)菌生物膜是由細(xì)菌和其分泌的胞外基質(zhì)在物體表面形成的高度組織化的多細(xì)

2、胞結(jié)構(gòu)，是細(xì)菌產(chǎn)生抗生素耐藥和逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的主要原因。金黃色葡萄球菌(S.aureus)是院內(nèi)感染的重要病原體之一，其致病機(jī)理與其生物膜的生成密切相關(guān)。本論文旨在研究NO對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響，為進(jìn)一步研究NO在生物膜中的作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 首先，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了S.aureus生物膜和浮游細(xì)菌中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)基因nos的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果

3、表明生物膜中nos的表達(dá)量明顯高于浮游菌，表明NO可能對(duì)生物膜的形成具有重要作用。為了檢測(cè)NO對(duì)生物膜的影響，通過(guò)外源加入NO供體SNP和NO清除劑PTIO觀察細(xì)菌生物膜的變化。結(jié)果表明SNP能夠明顯促進(jìn)S.aureus生物膜的生長(zhǎng)，而加入NO清除劑PTIO后能夠抑制SNP引起的生物膜的增加。 為了進(jìn)一步研究NO對(duì)生物膜的影響，利用同源重組方法構(gòu)建了S.aureusnos基因缺失突變株。在突變株的構(gòu)建過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)由于S.au

4、reus細(xì)胞壁厚而致密而且穿梭重組質(zhì)粒較大，使用目前的常規(guī)轉(zhuǎn)化方法無(wú)法導(dǎo)入外源性DNA，限制了遺傳操作的進(jìn)行。為了提高轉(zhuǎn)化效率，我們利用溶菌酶、溶葡萄球菌酶或TritonX-100在電擊轉(zhuǎn)化前對(duì)細(xì)菌進(jìn)行預(yù)處理，使轉(zhuǎn)化效率顯著提高，最高達(dá)到1.7×103cfu/μgDNA，從而建立了一種簡(jiǎn)便、高效的轉(zhuǎn)化方法。同源重組載體pMAD△nos的構(gòu)建是將PCR獲得的nos基因上下游同源序列和壯觀霉素抗性基因連入穿梭載體pMAD。pMAD△nos載

5、體首先轉(zhuǎn)入S.aureus RN4220，經(jīng)修飾后轉(zhuǎn)入S.aureus RN6390，利用溫度敏感性和抗生素抗性篩選同源重組體，成功構(gòu)建了S.aureus RN6390 nos基因缺失突變株。生物膜形成實(shí)驗(yàn)表明nos缺失突變株的生物膜形成能力明顯減弱，其生物膜的量比野生型減少了30％以上；最低生物膜消除濃度(MBEC)試驗(yàn)表明突變株生物膜對(duì)抗生素的敏感性提高為野生型的兩倍。 綜上所述，本論文建立了一種簡(jiǎn)便高效的S.aureus外