金黃色葡萄球菌生物膜形成及其alpha-毒素表達(dá)分析的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是醫(yī)院感染的重要病原菌之一，也是生物膜感染常見(jiàn)的病原菌。形成生物膜的金黃色葡萄球菌具有高度的耐藥性并能逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，其感染易慢性化并難于控制。因此對(duì)金黃色葡萄球菌等臨床重要病原菌的生物膜形成機(jī)制的研究已成為抗感染領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。 近年來(lái)對(duì)生物膜的研究已廣泛開(kāi)展，但目前對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成機(jī)制仍不清楚。多項(xiàng)關(guān)于金葡菌生物膜形成機(jī)制的研究涉及到alpha-毒素，

2、但對(duì)其在生物膜形成過(guò)程中的表達(dá)變化仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究選用第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院2004年7月-2004年12月分離的20株野生金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，通過(guò)生物膜形成實(shí)驗(yàn)和alpha-毒素編碼基因hla的PCR檢測(cè)，最終選取可形成明顯生物膜并攜帶hla基因的菌株X428進(jìn)行研究。采用免疫熒光技術(shù)和激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)對(duì)其生物膜形成過(guò)程進(jìn)行觀察，并對(duì)生物膜形成過(guò)程不同階段的alpha-毒素的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析，以期探討alpha-毒素在金

3、葡菌生物膜形成過(guò)程中的表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究生物膜的形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 研究分為三部分進(jìn)行： 1．金黃色葡萄球菌生物膜形成檢測(cè)及alpha-毒素編碼基因hla的PCR分析； 2．激光掃描共聚焦顯微鏡觀察金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程； 3．金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程中alpha-毒素的表達(dá)分析。 1．方法 1．1金黃色葡萄球菌生物膜形成檢測(cè)及alpha．毒素編碼基因hla的PCR分析

4、 金黃色葡萄球菌生物膜形成檢測(cè)采用96孔板番紅染色法；PCR法檢測(cè)alpha-毒素編碼基因hla，參照Genebank網(wǎng)站上(注冊(cè)號(hào)X55185)的基因序列，采用PrimerPremier5.0軟件針對(duì)hla設(shè)計(jì)引物，并對(duì)可形成明顯生物膜菌株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，在Genebank網(wǎng)站采用Blast軟件作同源性比較。 1．2激光掃描共聚焦顯微鏡觀察金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程 采用六孔板培養(yǎng)，蓋玻片上形成生物膜，分別于

5、接種2h、4h、8h、12h、16h、24h和48h后取出玻片，采用FITC-ConA和碘化丙啶(PI)分別標(biāo)記多糖和細(xì)菌DNA，激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察生物膜形成情況。 1．3金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程中alpha．毒素的表達(dá)分析 分別在細(xì)菌接種后4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h和48h采用三氯乙酸(TCA)沉淀法提取培養(yǎng)液中的細(xì)菌分泌蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，

6、然后以兔抗金葡菌alpha-毒素抗體作為第一抗體，羊抗兔IgG為第二抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)(western blot)alpha-毒素的表達(dá)，結(jié)果采用Image-pro-plus5.0軟件分析，并將分析結(jié)果用Office2003-Excel作圖。 2．結(jié)果 2．1金黃色葡萄球菌生物膜形成檢測(cè)與alpha-毒素編碼基因hla的PCR分析 在無(wú)外界因素干擾的條件下，本研究所選用的臨床分離金黃色葡萄球菌中70％(1

7、4/20)可形成肉眼可見(jiàn)的生物膜，其中以X321、X389和X428等3株最為明顯；20株金黃色葡萄球菌均能擴(kuò)增出目的基因片段。選用可形成明顯生物膜的菌株X428的PCR產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行Blast序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示與Genebank網(wǎng)站上注冊(cè)號(hào)為CP000255的金黃色葡萄球菌hla序列99％同源。 2．2激光掃描共聚焦顯微鏡觀察金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程。 通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成進(jìn)行觀察

8、，取得了一系列生物膜CLSM水平斷層圖像，2h僅有少量單個(gè)的細(xì)菌粘附于蓋玻片；4h細(xì)菌粘附形成由4-6個(gè)細(xì)菌組成的小菌落；8h細(xì)菌聚集成簇，但FITC-ConA單染效果無(wú)多糖成份產(chǎn)生：12h細(xì)菌菌落增大，多糖基質(zhì)產(chǎn)生；16h形成相對(duì)成熟的生物膜結(jié)構(gòu)，細(xì)菌被包被于多糖基質(zhì)中；24h和48h可見(jiàn)生物膜結(jié)構(gòu)變小，數(shù)量減少。 2．3生物膜形成不同階段alpha-毒素表達(dá)分析 從接種后4h到16h，alpha-毒素表達(dá)量逐漸增加，

9、成熟的生物膜結(jié)構(gòu)形成后，表達(dá)量雖然減少但仍維持于高水平。 3．結(jié)論 3．1在本研究培養(yǎng)條件下70％臨床分離金黃色葡萄球菌菌株(14/20)形成了肉眼可見(jiàn)的生物膜，表明大部分醫(yī)院感染的金黃色葡萄球菌可以形成生物膜。 3．2采用免疫熒光技術(shù)和激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究生物膜形成過(guò)程是一種簡(jiǎn)便可行的方法；在本研究中，接種后前4h細(xì)菌處于粘附階段，4h-12h處于聚集階段，12h-16h為分化成熟階段。多糖基質(zhì)產(chǎn)生并逐