脂肪酶工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化及脂肪酶的定點(diǎn)突變.pdf

1、在構(gòu)建擴(kuò)展青霉脂肪酶(PEL)一，二，三，四等多拷貝基因工程菌GS-pA0815-1ip的基礎(chǔ)上，從接種量、誘導(dǎo)劑量、pH值、發(fā)酵時間等方面對其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化以及7升全自動發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的初步摸索。有效地提高了擴(kuò)展青霉脂肪酶在畢赤酵母中的表達(dá)水平。本研究還利用定點(diǎn)突變技術(shù)對PEL進(jìn)行了分子突變，獲得一株最適作用溫度降低5．0℃、熱穩(wěn)定性略有提高的突變體脂肪酶。 1．PEL多拷貝工程菌的發(fā)酵條件優(yōu)化從接種量、誘導(dǎo)劑量、pH值

2、、發(fā)酵時間等方面對基因工程菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化和7升全自動發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的初步摸索，包括調(diào)整培養(yǎng)基成分，甲醇流加控制等。初步確定了該工程菌的搖瓶發(fā)酵條件：誘導(dǎo)起始菌體密度為1．0(0D600)，甲醇誘導(dǎo)濃度為1．5％，誘導(dǎo)起始pH為7．0-8．0，誘導(dǎo)培養(yǎng)時間為120h。使用DMGY培養(yǎng)基，發(fā)酵罐培養(yǎng)60h，酶活可達(dá)1250 U/ml，目的蛋白表達(dá)量為0.92mg/m1。發(fā)酵酶活提高至本課題組最初構(gòu)建的脂肪酶工程菌的4.8倍。

3、 2．PEL的定點(diǎn)突變采用重疊延伸PCR法對PEL基因進(jìn)行了Q176V、Y204D定點(diǎn)突變。將突變基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中表達(dá)，構(gòu)建了2種突變體。對兩種突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明：與野生型相比，突變體PEL-Q176V-GS最適作用溫度下降5.0℃，熱穩(wěn)定性(Tm)提高0.7℃，搖瓶發(fā)酵96h，酶活可達(dá)392U/ml，脂肪酶表達(dá)量約為300μg/ml:突變體PEL-Y204D-GS在橄欖油板上不能形成透明的水解圈，蛋白電泳未檢測到