葉籽銀杏microRNAs鑒定與表達(dá)分析.pdf

1、銀杏（Ginkgo biloba L.）屬于裸子植物門銀杏科銀杏屬，且單屬單種，系世界上現(xiàn)存最古老的樹種之一，在裸子植物中屬于原始類型。銀杏特殊的進(jìn)化地位奠定了其在植物分類、系統(tǒng)進(jìn)化、形態(tài)解剖、生物學(xué)等方面的突出研究?jī)r(jià)值。歷經(jīng)了漫長(zhǎng)的歷史進(jìn)化和人工栽植的干預(yù)，銀杏發(fā)生了明顯的變異，并根據(jù)銀杏葉片或種子的變異特征將銀杏劃分為不同品種。葉籽銀杏（Ginkgo biloba var.epiphylla Mak.）作為銀杏家族的特異種質(zhì)，特點(diǎn)在

2、于部分胚珠著生在葉片的邊緣，且葉籽銀杏具有穩(wěn)定的可遺傳變異，但目前對(duì)于葉籽銀杏的發(fā)生機(jī)制尚不可知。開展葉籽銀杏葉生胚珠的發(fā)生和發(fā)育過程中的分子機(jī)理和相關(guān)的遺傳調(diào)控機(jī)制的研究具有重要的理論意義。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)堿基的非編碼內(nèi)源小分子RNA，它通過作用靶基因mRNA來(lái)調(diào)控生物體內(nèi)基因的表達(dá)，方式主要有直接裂解mRNA或抑制靶基因的翻譯。且miRNA調(diào)控功能范圍廣泛，在植物器官分化、形態(tài)建成、

3、極性發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)、抗逆性等方面發(fā)揮重要的作用。開展葉籽銀杏miRNA層面的研究，將有助于探明葉生胚珠發(fā)生過程中miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控模式，為葉籽銀杏葉生胚珠發(fā)生的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　本研究以葉籽銀杏為研究材料，采用基于Solexa測(cè)序平臺(tái)的新一代高通量測(cè)序技術(shù)分別構(gòu)建發(fā)端期著生葉生胚珠葉片及正常葉片的sRNA文庫(kù)，并結(jié)合生物信息學(xué)方法，鑒定miRNAs的種類及表達(dá)豐度情況，篩選出兩樣品間差異miRNA

4、s;并以銀杏轉(zhuǎn)錄組mRNA文庫(kù)組裝的unigene為參考序列，對(duì)差異miRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)進(jìn)而了解葉生胚珠發(fā)生的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò);采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量分析葉籽銀杏兩樣品間差異miRNAs及其靶基因的表達(dá)情況。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.sRNA測(cè)序總體情況分析
　　分別構(gòu)建葉籽銀杏著生葉生胚珠葉片和正常葉片sRNA文庫(kù)，Solexa測(cè)序技術(shù)后分別獲得22，401，208和19，042，060條原始冗余序列，

5、通過去除接頭、低質(zhì)量等無(wú)意義序列后，得到21，876，638條和18，420，986條高質(zhì)量的純凈序列(clean sequence)，其中特異序列(unique sequence)分別為2，585，993條和2，640，731條。兩文庫(kù)中共有冗余序列占總數(shù)的88.49％，其中共有的特異序列占總共特異序列數(shù)量的15.91％。兩個(gè)文庫(kù)高通量測(cè)序長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)表明，兩文庫(kù)中長(zhǎng)度分布大體趨勢(shì)相似，均在21nt和24nt有兩個(gè)高峰。21 nt冗余

6、序列所占比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于24 nt，在著生葉生胚珠葉片和正常葉片文庫(kù)中分別占到65.96％和56.77％。
　　2.葉籽銀杏保守miRNAs
　　將獲得的高質(zhì)量sRNA序列與來(lái)自GenBank和Rfam(9.1)數(shù)據(jù)庫(kù)的非編碼RNA進(jìn)行比對(duì)篩選，去除其他非編碼RNA，將候選的sRNA與miRBase20.0比對(duì)篩選完美匹配的保守miRNAs。在兩個(gè)樣品中共鑒定來(lái)自23個(gè)家族的82個(gè)成員。除miR3522、miR1507、miR1

7、509、miR1314外，絕大部分miRNAs在其他物種中具有高度保守性。不同家族之間及同家族不同成員間的表達(dá)豐度變化較大?？傮w上，保守性越高，成員構(gòu)成越多的家族表達(dá)量越高，如miR168、miR172、miR396、miR156、miR390。反之，保守性較低，家族成員數(shù)較少的家族表達(dá)量相對(duì)較低。對(duì)樣品間保守miRNAs進(jìn)行差異分析，總計(jì)來(lái)自16個(gè)家族的25條保守miRNAs在樣品間存在顯著性差異，其中16條miRNAs在著生葉生胚珠

8、葉片中上調(diào)表達(dá)。采用qRT-PCR驗(yàn)證了15個(gè)保守miRNAs的差異表達(dá)情況，與高通量測(cè)序結(jié)果基本一致。
　　3.葉籽銀杏novel miRNAs
　　著生葉生胚珠葉片和正常葉片兩個(gè)sRNA文庫(kù)中，共預(yù)測(cè)53條novel miRNAs，其中25個(gè)miRNA*s也被檢測(cè)到。34條novel miRNAs在兩個(gè)文庫(kù)中均檢測(cè)到，11條僅在著生葉生胚珠葉片中檢測(cè);8條僅在正常葉片特異檢測(cè)。Novel miRNAs成熟序列長(zhǎng)度范圍在2

9、0-22nt，其中21 nt為主要類型，所占比例達(dá)66.04％。同保守miRNAs首位堿基偏好型一致，novel miRNAs首位堿基也以5'端U為主要類型。NovelmiRNAs前體序列長(zhǎng)度為67-268 bp，平均長(zhǎng)度為126bp，平均前體序列的MFE為-46.0 kcal/mol。Novel miRNAs表達(dá)豐度較保守miRNAs低。Novel miRNAs差異分析表明，10條novel miRNAs表達(dá)量在著生葉生胚珠葉片中顯著

10、上調(diào);相反，11條表達(dá)量下調(diào)。不同novel miRNAs之間表達(dá)水平差異較大，差異倍數(shù)在2到14之間。采用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了隨機(jī)挑選的6個(gè)novel miRNAs在兩樣品間的表達(dá)情況，與高通量測(cè)序結(jié)果基本一致。
　　4.差異miRNAs靶基因調(diào)控
　　對(duì)保守及novel miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，靶基因多為功能未知蛋白或預(yù)測(cè)蛋白，還有部分為涉及生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)等方面的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)差異miRNAs靶基因進(jìn)行GO注釋

11、，其中在著生葉生胚珠葉片中上調(diào)的38條miRNAs對(duì)應(yīng)靶基因111條unigene序列，而34條下調(diào)的miRNAs對(duì)應(yīng)88條unigene序列。著生葉生胚珠葉片中較多的靶基因富集在生物調(diào)節(jié)（biological regulation）、發(fā)育過程(developmentprocess)、生殖（reproduction）和信號(hào)傳遞（signaling）催化活性(catalyticactivity)等方面。葉籽銀杏葉生胚珠發(fā)生過程中，差異mi

12、RNAs可能通過參與植物激素調(diào)節(jié)及調(diào)控胚珠發(fā)育相關(guān)的基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮重要的調(diào)控作用。采用qRT-PCR對(duì)10個(gè)靶基因的差異表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)靶基因的表達(dá)模式基本與相應(yīng)的miRNA差異表達(dá)情況相反。
　　綜上所述，通過對(duì)葉籽銀杏著生葉生胚珠葉片和正常葉片構(gòu)建sRNA文庫(kù)，獲得葉籽銀杏保守及novel miNRAs，預(yù)測(cè)樣品間差異表達(dá)的miRNAs對(duì)應(yīng)的靶基因的功能，并采用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證部分miRNAs及其靶基因的表達(dá)。miR