蛻皮激素引發(fā)的鈣離子-鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及蛋白激酶A信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對基因組轉(zhuǎn)錄的調(diào)控.pdf

1、研究背景及存在的科學(xué)問題:
　　蛻皮激素(20-Hydroxyecdysone，20E)在昆蟲蛻皮和變態(tài)中起主導(dǎo)作用。過去認(rèn)為20E直接進(jìn)入細(xì)胞啟動基因轉(zhuǎn)錄，即基因組途徑。近年的研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上存在響應(yīng)蛻皮激素的G蛋白偶聯(lián)受體(ErGPCRs)，它們能介導(dǎo)20E引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的迅速升高，進(jìn)而活化蛋白激酶C(PKC)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即非基因組途徑。胞內(nèi)Ca2+濃度升高后需要與胞內(nèi)多種鈣結(jié)合蛋白形成復(fù)合物來發(fā)揮作用，如鈣調(diào)蛋

2、白(calmodulin，CaM)。CaM可以結(jié)合4個Ca2+形成Ca2+/CaM活性復(fù)合物，進(jìn)而結(jié)合鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，使CaMKⅡ發(fā)生自磷酸修飾而活化?；罨蟮腃aMKⅡ在細(xì)胞核內(nèi)可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子或其他蛋白，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。但CaMKⅡ在20E調(diào)控的Ca2+信號途徑中的功能及作用機(jī)理尚不清楚。果蠅中的研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上的多巴胺/蛻皮激素受體(DmDopEcR)可以和20E結(jié)合并可以介導(dǎo)胞內(nèi)cAMP濃度

3、升高;蛻皮激素在30 s內(nèi)誘導(dǎo)家蠶前絲腺細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高，表明20E可能誘導(dǎo)cAMP介導(dǎo)的非基因組信號途徑。cAMP與依賴cAMP的蛋白激酶A(PKA)調(diào)節(jié)亞基(PKAR)結(jié)合，使其與催化亞基(PKAC)分離，進(jìn)入細(xì)胞核，使環(huán)磷腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化并結(jié)合到環(huán)磷腺苷應(yīng)答元件(CRE)上，調(diào)控基因表達(dá)，即PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。然而20E激發(fā)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其在調(diào)節(jié)昆蟲變態(tài)發(fā)育中的作用及機(jī)理并不清楚。
　　

4、方法：
　　本論文用鱗翅目昆蟲棉鈴蟲作為實(shí)驗(yàn)材料，并利用棉鈴蟲表皮細(xì)胞系(HaEpi)平臺，研究了CaMKⅡ在20E調(diào)控的Ca2+信號途徑中的功能及作用機(jī)理、PKAC在20E調(diào)控的昆蟲變態(tài)發(fā)育中的作用及機(jī)理。
　　研究結(jié)果:
　　1.20E誘導(dǎo)CaMKⅡ磷酸化進(jìn)而通過調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)EcRB1/USP1轉(zhuǎn)錄異源二聚體的形成來調(diào)控基因的啟動。
　　在棉鈴蟲蛻皮期和變態(tài)期CaMKⅡ表達(dá)量升高。在蟲體中通過RNA干擾技術(shù)(

5、RNAi)沉默CaMKⅡ?qū)е?0E誘導(dǎo)基因表達(dá)量下降，進(jìn)而導(dǎo)致棉鈴蟲不能順利完成變態(tài)。在HaEpi細(xì)胞系中，20E快速誘導(dǎo)CaMKⅡ第290位蘇氨酸發(fā)生磷酸化，并使CaMKⅡ進(jìn)入細(xì)胞核。GPCR抑制劑Suramin、磷脂酶C(PLC)抑制劑U73122以及1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)抑制劑光溜海綿素(Xestospongin C，XeC)對20E誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高及CaMKⅡ磷酸化有顯著抑制作用。在細(xì)胞內(nèi)沉默ErGP

6、CR1、ErGPCR2以及G蛋白alpha q（Gαq）也能抑制20E誘導(dǎo)的CaMKⅡ磷酸化。細(xì)胞核內(nèi)的CaMKⅡ介導(dǎo)去乙?；?(HDAC3)的磷酸化并出核，維持轉(zhuǎn)錄因子USP1第303位賴氨酸乙?；?，使其與EcRB1形成轉(zhuǎn)錄異源二聚體，并與蛻皮激素響應(yīng)元件(EcRE)結(jié)合。以上結(jié)果說明，20E通過ErGPCRs-、Gαq-、PLC-介導(dǎo)Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控CaMKⅡ磷酸化和核移位，進(jìn)而調(diào)節(jié)USP1賴氨酸乙?；⑿纬蒃cRB1/U

7、SP1異源二聚體，最終調(diào)控基因組途徑的啟動。
　　2.20E引發(fā)細(xì)胞內(nèi)PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑磷酸化CREB上調(diào)基因組轉(zhuǎn)錄途徑。
　　在棉鈴蟲幼蟲通過RNAi沉默PKA催化亞基1（PKAC1，導(dǎo)致幼蟲不能順利完成化蛹，并且20E誘導(dǎo)基因的表達(dá)量下降。GPCR抑制劑Suramin、cAMP生成抑制劑鹽酸布比卡因、以及沉默ErGPCR2都能抑制20E介導(dǎo)的PKAC1的磷酸化。PKAC1在細(xì)胞核內(nèi)直接磷酸化CREB的第143位絲氨酸殘基

8、。20E可以誘導(dǎo)含有CRE及EcRE核心元件的pHR3-P-IE1-RFP-His質(zhì)粒表達(dá)紅色熒光蛋白。GPCR抑制劑 Suramin、PKA抑制劑H89、以及沉默ErGPCR1和ErGPCR2都能抑制20E對該RFP的上調(diào)表達(dá)。缺失質(zhì)粒中的CRE后，20E誘導(dǎo)RFP表達(dá)的能力下降。20E誘導(dǎo)CREB磷酸化并結(jié)合到CRE上，沉默PKAC1后CREB不能磷酸化因而不能結(jié)合到CRE上。這些結(jié)果說明，20E通過ErGPCR2介導(dǎo)PKAC1磷酸

9、化，進(jìn)而使CREB發(fā)生磷酸化并結(jié)合到CRE元件上，增強(qiáng)20E誘導(dǎo)基因表達(dá)。
　　結(jié)論及意義:
　　20E調(diào)控CaMKⅡ氨基酸序列的第290位蘇氨酸磷酸化并入核，催化HDAC3磷酸化并出核，從而維持USP1在303位賴氨酸的乙酰化修飾，與EcRB1結(jié)合形成EcRB1/USP1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體并結(jié)合在EcRE上，啟動基因轉(zhuǎn)錄。20E通過ErGPCR2介導(dǎo)PKAC1磷酸化，PKAC1直接磷酸化CREB中的第143位絲氨酸殘基，使CREB