睪酮時間分辨熒光免疫檢測試劑及降鈣素原膠體金半定量免疫層析檢測試劑的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 免疫標記技術指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學（或生物）發(fā)光劑等作為示蹤物，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應，并借助于熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標檢測儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，應用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定的方法。
　　 時間分辨熒光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是

2、一種靈敏的高端定量免疫檢測技術，是以鑭系稀土離子作為標記物來標記抗原或抗體，因鑭系稀土離子具有獨特的熒光特性，該技術能夠獲得極高的信噪比，從而具有很高的靈敏度，且還具有標記物制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應用范圍十分廣泛等優(yōu)點。時間分辨熒光免疫分析相對于酶免分析、放射免疫分析有更高的臨床應用價值。該技術適用于各種抗原抗體的臨床檢測，在市場上已得到廣泛應用。
　　

3、 睪酮作為性激素的一種，是臨床激素六項檢測中的重要組成部分，目前臨床上常用的睪酮檢測試劑主要是PE公司生產(chǎn)的時間分辨睪酮檢測試劑及進口的化學發(fā)光法睪酮檢測試劑，于是開發(fā)國產(chǎn)的睪酮檢測試劑成為我們關注的焦點。睪酮由于是甾類激素，屬小分子半抗原，98％的睪酮分子在血清中均是以與激素結(jié)合蛋白結(jié)合的狀態(tài)存在，這些特殊性均為睪酮定量檢測試劑的研發(fā)工作帶來了困難與挑戰(zhàn)。因此，在睪酮試劑的研制過程中，我們將異源橋式搭配理念引入研制過程中，以睪酮的結(jié)

4、構(gòu)類似物雄烯二酮為載體，在其C3位引入含有五個亞甲基的臂，在此結(jié)構(gòu)基礎上合成NHS活潑酯，其與BSA偶聯(lián)后進行Eu標記從而作為反應體系中的示蹤物，在以一步間接競爭法的模式基礎上研制了此試劑用于血清、血漿中睪酮含量的測定。
　　 膠體金免疫層析是建立在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術和免疫膠體金標記技術基礎上的以膠體金為標記物，利用特異的抗原抗體反應來放大反應，通過直接觀察就可以判定結(jié)果的新技術。該技術具有簡單、快速

5、、準確和無污染等優(yōu)點，在臨床醫(yī)學檢測、激素檢測、食品安全檢測、藥物殘留和毒品快速檢測諸多診斷領域迅速發(fā)展[1]。隨著即時檢驗(POCT)產(chǎn)業(yè)的深入發(fā)展，膠體金試劑由于其本身所帶有的快速、簡便、易于攜帶、便于深入社區(qū)及邊遠山區(qū)等特點，成為目前POCT發(fā)展的主要領域，從而那些與發(fā)病急、危害大的疾病相關的檢測指標的膠體金試劑的需求越來越大。
　　 降鈣素原(PCT)作為一種與膿毒血癥相關的特異性檢測指標，只有當細菌感染時降鈣素原才會升

6、高，在其他的炎性反應中如病毒感染、自身免疫性疾病和創(chuàng)傷等均不會升高，所以其具有良好的特異性及靈敏度，能用于區(qū)分感染或非感染引起的炎癥、器官功能障礙以及休克。從產(chǎn)生和消除的動力學過程來看，PCT也是最適合用作臨床診斷指標的。加之膿毒血癥能夠在短時間內(nèi)對病人的生命造成嚴重威脅，故其檢測試劑的膠體金化也成為臨床醫(yī)生及診斷試劑廠家的關注的重點。但是目前檢驗領域僅有幾家公司有相關試劑的生產(chǎn)能力，國內(nèi)廠家?guī)缀鯇儆诳瞻谞顟B(tài)，大部分醫(yī)院所使用的相關檢測

7、試劑全部依賴進口，如Braham公司生產(chǎn)的半定量PCT試劑，但其所具有的一個重要的缺陷是價格昂貴，無法滿足社區(qū)與邊遠山區(qū)醫(yī)療需求，故研制國產(chǎn)的PCT膠體金半定量試劑成為我們的主要目標。國產(chǎn)PCT試劑一直寥寥無幾的主要原因是沒有性能優(yōu)越的原料，大部分存在靈敏地低或特異性差的問題。為了更好的解決原料問題，我們對市售的PCT抗體進行了大規(guī)模的搜索工作，利用時間分辨免疫熒光檢測進行原料配對等初篩工作，并且發(fā)現(xiàn)了滿足半定量膠體金試劑研發(fā)要求的原料

8、在TRFIA熒光值方面的特殊性，最終通過雙抗體夾心法研制了能夠進行PCT半定量檢測的膠體金試劑。
　　 本文主要從制備睪酮及睪酮類似物的化學衍生物及其偶聯(lián)物、睪酮時間分辨免疫熒光檢測試劑的研究及降鈣素原半定量檢測試劑的研究共計三個方面對所進行的研究做一總結(jié)。
　　 第一部分內(nèi)容中，著重介紹了睪酮及睪酮類似物的化學衍生物及其偶聯(lián)物的制備，制備過程以睪酮或睪酮類似物-雄烯二酮作為合成起始原料，向上述結(jié)構(gòu)中引入O-(羧甲基)羥

9、胺半鹽酸鹽(O-(carboxymethyl)hydroxylaminehemi-hydrochloride)或氨氧基已酸氫溴酸鹽(6-Aminooxy-hexanoicacid，hydrobromide)作為臂結(jié)構(gòu)。隨后在NHS及DCC的條件下，攪拌過夜，將相應的肟合成NHS活潑酯結(jié)構(gòu)，利用閃氏柱層析對其進行純化，除去未反應的成分。最后將將活潑酯與BSA以摩爾比15∶1的比例進行偶聯(lián)，反應于室溫下攪拌過夜，次日以分子篩進行純化，并用B

10、CA法分別檢測四種睪酮偶聯(lián)物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ的濃度分別為0.8 mg/ml、0.9mg/ml、0.9mg/ml及0.8mg/ml。
　　 第二部分著重介紹了人睪酮時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的研究過程。首先利用高嶺土、活性炭制備去激素血清作為校準品配制用基質(zhì)，并配制睪酮校準品如口下:A(0nmol/L)、B(1.0 nmol/L)、C(3.2nmol/L)、D(6.8nmol/L)、E(14nmol/L)及F(51.2nmol/L

11、)。第二步進行睪酮偶聯(lián)物的標記，每種偶聯(lián)物都取1mg進行標記，按照偶聯(lián)物與Eu3+質(zhì)量比2∶1的比例加入銪標記配體，標記體系均為200μl，將待標記偶聯(lián)物和銪標記試劑充分混勻后置于搖床上室溫孵育18h。次日過分子篩層析純化。根據(jù)280 nm蛋白的吸收峰收集洗脫液，即為睪酮檢測原。利用BCA法檢測睪酮檢測原的濃度，然后向其中加入銪標保護液，置-20℃保存。最終檢測到睪酮檢測原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ的濃度分別為132μg/ml、135μg/ml、1

12、38μg/ml和140μg/ml。第三步是摸索羊抗鼠IgG的最適包被濃度，設置包被梯度，用包被液將羊抗鼠IgG多抗稀釋至不同濃度后進行，37℃過夜，封閉，真空抽干，-20℃冷凍保存，檢測在不同的包被濃度下，睪酮校準品A的熒光值，通過熒光值的比較選擇最適的羊抗鼠IgG包被濃度，最終確定羊抗鼠IgG的最適包被濃度為6μg/ml。第四步是進行四種睪酮檢測原的性能比較，根據(jù)各個睪酮檢測原的標準曲線分別確定其ED50，選擇ED50最低的檢測原作為

13、體系中所使用的示蹤物，最終確定睪酮檢測原Ⅳ為最佳檢測原。第五步確定最適的樣本加入量，將樣本加入量做梯度，檢測在不同加入量條件下的校準品A的熒光值(Bmax)及校準品B的熒光值，并計算B/Bmax的比值，選擇比值相對較小并且不易對操作引入誤差的樣本量，最終確定最適樣本加入量為25μl。第六步確定抗睪酮單克隆抗體及檢測原的最佳使用濃度，將二者的濃度進行梯度稀釋，利用棋盤滴定法進行實驗，根據(jù)靈敏度及A點熒光值來選擇最適二者最適的稀釋度，最終確

14、定抗睪酮單克隆抗體的最佳使用濃度為6ng/ml，檢測原的最佳使用濃度為1μg/ml。由于血清中99％的睪酮是以與SHBG（性激素結(jié)合蛋白）相結(jié)合的形式存在，故反應緩沖液中阻斷劑的存在對于血清睪酮含量的準確測定具有重要的意義，于是第七步我們進行阻斷劑最佳濃度的測定，將二甲氧雌二醇的濃度做梯度稀釋，根據(jù)不同阻斷劑濃度下A點的熒光值及各個點的B/Bmax進行比較，選擇靈敏度比較高且阻斷劑的加入對于A點熒光值的影響程度在5％以內(nèi)的濃度為阻斷劑最

15、適使用濃度，最終確定阻斷劑的最適使用濃度為30μg/ml。第八步進行最佳反應時間的確定，將反應時間做梯度，檢測不同反應時間下校準品A、B、C、D、E和F的熒光值與Btotal的比值，以各個校準品的反應都趨于平衡的時間作為體系的最佳反應時間，最終將最適反應時間定為90分鐘。待試劑的各個參數(shù)都確定完畢后，對試劑的整體性能進行評價，平行測定十次校準品A的熒光值，并計算其標準差，用A點熒光值的平均值減去2倍標準差，將得到的熒光值帶入標準曲線，所

16、得的濃度即為分析靈敏度。經(jīng)計算，分析靈敏度為0.15nmol/L;取不同濃度三個樣本分別進行梯度稀釋，不同稀釋度條件下的測量濃度與理論濃度的比值即為稀釋回收率，此參數(shù)反映體系的健全性，本試劑的稀釋回收率在98.8％-101.4％之間，稀釋倍數(shù)與含量呈線性關系，說明本分析具有良好的健全性;研究此反應的特異性，將臨床上可能與睪酮檢測有交叉反應的各類激素樣本在睪酮檢測體系中進行檢測，取睪酮體系ED50所對應的睪酮濃度與交叉物質(zhì)在睪酮體系中達到

17、A點熒光值一半時的濃度的比值，即為二者之間的交叉反應率，經(jīng)實驗證實，本試劑與孕酮的交叉反應率為0.14％，與雙氫睪酮的交叉反應率為0.38％，與雌二醇的交叉反應率為0.07％，與17-羥基孕酮的交叉反應率為0.02％，與雌三醇的交叉反應率為0.09％，與Danazol的交叉反應率為0.12％;在精密度分析方面，采用三個伯樂質(zhì)控品，各設10個復孔，同一次實驗內(nèi)和不同實驗中重復多次測定，分析內(nèi)變異系數(shù)為2.5-6.6％，分析間變異系數(shù)為3.

18、6-7.8％，精密度良好。以SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，在線性評估方面應用直線回歸分析方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。利用Logit函數(shù)將睪酮的S形競爭曲線轉(zhuǎn)換為直線，以此直線的相關系數(shù)評價體系的性能，轉(zhuǎn)換為Logit函數(shù)后，線性回歸方程為Y=1.453-2.193X，相關系數(shù)為r=0.99，R2=1.000，F(xiàn)=7303.334，P＜0.001，說明此競爭法體系的線性關系非常好;最后將本試劑與PE試劑做相關分析，分

19、別對84例樣本進行檢測，評價兩種試劑之間的檢測相關性，相關性方程為Y=0.991X-0.331，相關系數(shù)為r=0.988，R2為0.977，F(xiàn)=3407.808，P＜0.001，說明本試劑能夠很好的滿足臨床檢測的要求。
　　 本論文的第三個部分主要闡述了降鈣素原膠體金半定量免疫層析檢測試劑的研制過程。研制過程中，首先進行NC膜的篩選，對幾種候選NC膜通過毛細管流時、靈敏度、反應結(jié)果出現(xiàn)時間及試劑條背景等指標的比較確定本試劑最終用

20、膜，最終選取Millipore公司生產(chǎn)的HF135作為本試劑用膜;第二步進行的是膠體金結(jié)合墊材質(zhì)的篩選，對候選的膠體金用玻璃纖維通過材質(zhì)、非特異性吸附、膠體金能否恒定釋放、金標墊上膠體金溶解與釋放速度及能否預防溶血等方面進行比較后確定所選取的材質(zhì)，經(jīng)過一系列實驗，最終確定選擇Millipore的玻璃纖維GFCP103000作為本試劑用的膠體金結(jié)合墊材質(zhì);研制過程的第三步是原料的篩選過程，主要是通過軟件SPSS13.0對TRFIA數(shù)據(jù)進行

21、線性回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，計算r值及P值，經(jīng)分析，組合1至組合9均表現(xiàn)為線性性差，r值分別為0.982、0.958、0.973、0.966、0.786、0.859、0.884、0.977及0.458，P值分別為0.003、0.01、0.005、0.007、0.214、0.062、0.047、0.004及0.438，組合10及組合11經(jīng)分析線性性好，r值分別為0.991及0.993，P值均為0.001。其后再利用膠體

22、金方法對2對初篩得到的抗體組合進行進一步評估，評價配對后的特異性、靈敏度、比色區(qū)分度等指標，確定最佳配對，經(jīng)過嚴密的實驗設計及嚴謹?shù)膶嶒炦^程，最終確定使用Hytest的16B5作為包被原料，杭州啟泰的MJG03作為標記原料。第四步是對所確定的標記原料進行最適標記條件的摸索，利用氯化鈉法確定原料的最適標記pH值和最適標記量，經(jīng)實驗可知，MJG03的最適標記pH條件為1ml金中加入0.1M的K2CO315μl，標記量為每100ml膠體金溶液

23、標記1.5mg。第五步是確定包被用原料的包被條件，通過設置不同的包被條件，檢測在不同包被條件下試劑的靈敏度、特異性、T線顯色程度等指標，選擇T線性能最好的條件，最終選擇10mM PBS(pH7.2)作為包被液。第六步進行金標抗體使用濃度及包被濃度的摸索，通過將噴金量及包被濃度做梯度，選擇能夠同時滿足靈敏度高、特異性好且0.5ng/ml、2ng/ml及10ng/ml三個濃度顯色差異大的組合，經(jīng)過棋盤滴定法實驗，最終確定金標抗體的使用濃度為

24、OD535=40，噴金量為0.5μl/mm，檢測線抗體16B5的工作濃度為2.5mg/ml，劃線量為0.12μl/mm;質(zhì)控線抗體的最佳工作濃度為1mg/ml，劃線量為0.12μl/mm。在確定最佳噴金量及包被濃度的前提下，第七步進行比色卡標準的建立，將0.5ng/ml、2ng/ml及10ng/ml三個濃度的陽性樣本各測定20次，分別選擇20次結(jié)果的平均顯色度作為比色卡的標準。所有試劑相關的參數(shù)都確定后，對試劑性能進行進一步評估，通過測

25、定檢測不同降鈣素原濃度的樣本，最終確定試劑的最低檢出量為0.2ng/ml;利用C-反應蛋白、降鈣素、類風濕因子陽性樣本評價試劑的特異性，發(fā)現(xiàn)本試劑與10mg/ml的C-反應蛋白、6.4mg/ml的降鈣素及500IU/ml的類風濕因子均無交叉反應，特異性良好;血清血漿樣本檢測結(jié)果一致性考核方面，將PCT標本分別處理成血清、肝素抗凝血漿、EDTA抗凝血漿樣本，確定血清、血漿檢測結(jié)果是否一致，最終通過實驗發(fā)現(xiàn)試劑在這兩種樣本的檢測性能上具有一