白斑綜合征病毒(WSSV)膠體金免疫半定量快速檢測試紙條的研制與應(yīng)用.pdf

1、白斑綜合征病毒(WSSV)是在全世界范圍內(nèi)為蝦類養(yǎng)殖業(yè)帶來損失最大的病毒之一，且目前尚缺乏有效的治療措施，因此在WSSV感染的早期，能夠?qū)崿F(xiàn)對WSSV快速、定量檢測，為預(yù)防控制該病的暴發(fā)、預(yù)警預(yù)報和減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。針對WSSV定量檢測目前常采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實時定量PCR、雙抗體夾心ELISA等方法，但是現(xiàn)有的這些檢測方法在實際應(yīng)用中皆在不同程度上受到花費高、耗時長、需要專業(yè)儀器等方面的限制，針對上述情況，本實驗研

2、制了一種WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙，其檢測結(jié)果肉眼可見，不需要專業(yè)儀器設(shè)備，整個過程僅需要10min，適用于養(yǎng)殖現(xiàn)場的蝦類、蟹類等甲殼類中WSSV的半定量快速檢測。
　　本實驗具體如下所述，復(fù)蘇WSSV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞2E6、1G12、3B7、4G9和5D2，利用辛酸-硫酸銨法純化腹水單抗。選擇單抗2E6作為金標(biāo)抗體，以檸檬酸鈉還原法制備膠體金，通過膠體金標(biāo)記單抗2E6制備金標(biāo)抗體，使用噴膜儀將制備的金標(biāo)單抗2E

3、6液體均勻噴涂到玻璃纖維上，即為金標(biāo)墊，分別將不同濃度的單抗4G9包被于硝酸纖維素膜(NC膜)分別作為檢測線T1，檢測線T2和檢測線T3，將羊抗小鼠IgG包被于硝酸纖維素膜(NC膜)，作為質(zhì)控線。并組裝金標(biāo)墊、NC膜與樣品墊、吸收墊和塑料底板制成WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙。另外對其進(jìn)行了優(yōu)化，選擇Whatman AE99作為WSSV檢測試紙條的NC膜，單抗1G12、3B7、4G9、5D2按4∶2∶2∶1的比例混合作為試紙條

4、檢測線抗體，優(yōu)化后的試紙條的最低檢測限為783ng/ml。使用WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙檢測樣品，若檢測線T1、T2、T3和質(zhì)控線都呈現(xiàn)紅色時，說明WSSV蛋白濃度大于6.26μ g/ml;若檢測線T1、T2和質(zhì)控線顯現(xiàn)紅色時，說明WSSV蛋白濃度位于3.13μ g/ml～6.26μ g/ml之間;若只有檢測線T1和質(zhì)控線顯現(xiàn)紅色時，說明WSSV蛋白濃度位于783ng/ml～3.13μ g/ml;若只有質(zhì)控線顯現(xiàn)紅色時，表

5、明WSSV蛋白濃度小于783ng/ml，或者不含WSSV。
　　建立了白斑綜合征病毒實時熒光定量PCR技術(shù)，分別利用制備的WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙和建立的WSSV實時熒光定量PCR技術(shù)，跟蹤檢測了感染W(wǎng)SSV后克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）組織內(nèi)病毒濃度的動態(tài)變化。注射WSSV粗提液感染克氏原螯蝦，在感染后0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h分別取螯蝦鰓、血淋巴、心

6、臟、附肢、造血組織和肌肉，提取各組織DNA，實時熒光定量PCR測定WSSV濃度，結(jié)果顯示，WSSV感染后3h在附肢、鰓、血淋巴和造血組織中檢測到病毒，12h時在各樣品組織中皆檢測到病毒，但濃度較低;24～48h內(nèi)WSSV濃度呈指數(shù)增長，此時螯蝦出現(xiàn)少量死亡;60～72h內(nèi)各組織中WSSV數(shù)量達(dá)到緩慢增長的平臺期，螯蝦累計死亡率快速增高。螯蝦體內(nèi)WSSV濃度與螯蝦死亡率呈密切的正相關(guān)關(guān)系，其中附肢中WSSV動態(tài)變化趨勢能夠較好的代表多數(shù)樣

7、品組織中的WSSV增殖規(guī)律，因此在實驗室及養(yǎng)殖場WSSV檢測中可將附肢作為首選的檢測組織。在感染W(wǎng)SSV后不同時間點WSSV在各組織中的分布也有很大差異，分析各組織中WSSV分布的差異，推測WSSV最先在血淋巴中大量復(fù)制，隨后由于血淋巴循環(huán)造成對其它組織的感染。使用WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙檢測血淋巴、鰓中不用時間點WSSV濃度，結(jié)果顯示試紙條所測樣品結(jié)果與實時熒光定量PCR檢測結(jié)果一致率為100％。因而，WSSV膠體金免