柑橘褐斑病菌SNF1和FTR1基因生物學功能初步研究.pdf

1、由交鏈格孢菌(Alternaria alternata)引起的柑橘褐斑病主要為害感病品種的葉片、枝梢、花瓣和果實，嚴重時造成葉片和果實大量脫落，導致柑橘減產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)柑橘褐斑病菌產(chǎn)生的ACT毒素及對活性氧的解毒機制是其侵染寄主致病所必需的，但當前對于毒素合成機制及解毒活性氧的分子機理仍缺乏深入的系統(tǒng)研究，同時對病原菌基礎代謝相關研究開展尚不充分。蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶SNF1在多種植物病原真菌中被證實參與對生長發(fā)育及致病性的調(diào)控，且轉錄組測

2、序結果顯示H2O2可誘導柑橘褐斑病菌AaSNF1基因的表達。高親和鐵離子通透酶FTR1參與真菌胞內(nèi)鐵代謝，研究人員推測柑橘褐斑病菌可能存在一套由還原性鐵離子攝取系統(tǒng)參與的對活性氧的解毒。因此，為進一步了解柑橘褐斑病菌致病機理，本研究聚焦柑橘褐斑病菌SNF1和FTR1基因，初步分析其在生長致病過程中發(fā)揮的作用。
　　本試驗優(yōu)化柑橘褐斑病菌原生質體制備條件，初步完善PEG介導的原生質體遺傳轉化體系。同時通過基因敲除及回補，初步分析SN

3、F1和FTR1在柑橘褐斑病菌生長發(fā)育及致病過程中的作用，得到如下結果：
　　1.柑橘褐斑病菌在PDB中150 rpm培養(yǎng)36 h，以0.7 M NaCl為穩(wěn)滲劑，1%Kitalase于30℃酶解2.5 h時所釋放原生質體數(shù)量最多，達4.36×108個/mL，可滿足轉化需要。以柑橘褐斑病菌不同基因轉化該方法制備的原生質體，在抗性平板上均能收獲足量的轉化子，表明該優(yōu)化方法達到預期效果。
　　2.應用Split-marker方法構

4、建AaSNF1、AaFTR1基因敲除盒，利用PEG介導原生質體遺傳轉化，經(jīng)抗生素篩選、PCR及Souhern雜交驗證得到AaSNF1和AaFTR1基因敲除菌株。利用酵母高效同源重組原理構建基因回補載體，遺傳轉化后得到回補菌株CP-S-2和CP-F-2。
　　3.野生型與突變體表型分析結果顯示：AaSNF1基因參與調(diào)控柑橘褐斑病菌的菌絲生長、產(chǎn)孢、碳源利用、細胞壁功能及致病性。具體結果如下：(1)ΔAaSnf1菌株氣生菌絲不發(fā)達，菌

5、落顏色變深，在不同培養(yǎng)基上生長速度下降，PDA培養(yǎng)基上菌落直徑減小19%。(2)與野生型相比，ΔAaSnf1突變體產(chǎn)孢量下降70%，分生孢子顏色變淺，直徑變小。PDB培養(yǎng)基中，突變體孢子萌發(fā)延滯明顯，野生型在接種2 h時萌發(fā)率為30%左右，而突變體僅有5%的孢子正常萌發(fā)。直至8 h時，野生型已有90%以上的孢子萌發(fā)，而ΔAaSnf1突變體萌發(fā)率僅50%左右。野生型在接種12 h時孢子基本全部萌發(fā)，變體菌株萌發(fā)率上升至80%。(3) Aa

6、SNF1的缺失導致菌株致病力顯著下降，突變體無病斑或僅形成小斑。在多聚半乳糖醛酸、蔗糖、酒精為單一碳源的培養(yǎng)上，ΔAaSnf1突變體出現(xiàn)生長缺陷，菌落直徑比野生型分別下降35%、37%和45%。(4)相比于野生型，ΔAaSnf1突變體在含細胞壁脅迫因子的培養(yǎng)基上表現(xiàn)出更強的耐受性，并且隨脅迫因子濃度的升高表現(xiàn)更為顯著。但ΔAaSnf1突變體在含不同穩(wěn)滲劑及H2O2的培養(yǎng)基上與野生型生長無明顯差異?；匮a菌株CP-S-2生長致病恢復至野生型

7、水平。
　　4. AaFTR1在低鐵環(huán)境下被誘導表達，相對表達量為對照組的32倍。AaFTR1的缺失導致柑橘褐斑病菌胞內(nèi)鐵含量顯著下降，且低鐵環(huán)境下降更明顯。但突變體表型分析結果顯示AaFTR1基因的缺失并不影響菌株的生長、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)、滲透壓脅迫、氧化脅迫及致病性。雖然突變體致病力與野生型無差異，但RT-qPCR分析表明，AaFTR1基因在侵染柑橘致病的過程中表達水平呈現(xiàn)明顯的先上升后下降趨勢，在侵染初期(接種48 h)達到峰