細(xì)胞miRNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)復(fù)制的相關(guān)研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)可引起母豬晚期流產(chǎn)和仔豬呼吸疾病等臨床癥狀。由于該病的病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)具有較高的變異性，且可造成持續(xù)性感染和免疫抑制，因而疫苗免疫防控比較困難。近年來，越來越多的證據(jù)表明宿主細(xì)胞microRNA(miRNA)是機體先天性/獲得性免疫以及宿主-病原體相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中不可或缺的調(diào)節(jié)因子。通過直接結(jié)合病毒RNA抑制基因表達(dá)或間接作用于某個細(xì)胞成分進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)通路和調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答，

2、miRNA在抗病毒感染和復(fù)制方面也扮演了重要的角色。
　　為篩選具有抑制PRRSV復(fù)制潛在功效的miRNA，我們合成了15條miRNA模擬物，其序列在不同物種之間具有高度保守性，且已有相關(guān)文獻(xiàn)表明它們在先天性免疫和/或抗病毒方面具有一定功效。本研究利用體外轉(zhuǎn)染miRNA模擬物或陰性對照后再感染相同劑量病毒的方法鑒定具有抗PRRSV作用的miRNA，并從病毒學(xué)水平、基因組復(fù)制水平和蛋白翻譯水平證明其抑制作用，并進(jìn)一步發(fā)掘其發(fā)揮作用的

3、機制。結(jié)果表明，15條候選miRNA中僅有miR-26a可以強烈抑制PRRSV的復(fù)制。體外過表達(dá)miR-26a對不同毒力、不同基因型的PRRSV毒株均有抑制作用，且作用的強弱與轉(zhuǎn)染劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。突變miR-26a種子區(qū)(Seed Region)可恢復(fù)病毒滴度，然而突變種子區(qū)以外局域并不影響其抑制作用。通過熒光素酶報告基因試驗，我們發(fā)現(xiàn)miR-26a不能直接作用于PRRSV基因組RNA。另一方面，過表達(dá)miR-26a可以顯著上

4、調(diào)Ⅰ型干擾素和干擾素刺激基因MX1、ISG15的表達(dá)，這表明miR-26a可能通過調(diào)控Ⅰ型干擾素通路進(jìn)一步發(fā)揮抗PRRSV感染作用。
　　隨后，我們利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測了PRRSV vJX143基因組上潛在的miRNA靶位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其5'末端第155-162位核苷酸與miR-130種子區(qū)以7mer-m8的結(jié)合方式完全互補配對。經(jīng)序列比對分析，其保守性在21株具有代表性的北美型毒株中達(dá)100％，而在3株歐洲型毒株中卻并不存在。恰

5、如預(yù)料的是，轉(zhuǎn)染miR-130家族，尤其是miR-130b可以顯著抑制PRRSV的體外復(fù)制。我們還發(fā)現(xiàn)這種抑制作用表現(xiàn)在多株北美型病毒，而對歐洲株無效。熒光素酶報告試驗證明，miR-130b可以顯著降低pGL3-5UTR熒光素酶的活性。同時，miR-130b不激活PAM細(xì)胞中IFN-α和TNF-α中的表達(dá)，揭示miR-130的抗PRRSV作用是通過直接靶向PRRSV特異性的結(jié)合位點，而非激活先天性免疫來實現(xiàn)的。另外，作為一種無抗原性的小

6、分子，miRNA被認(rèn)為在抗病毒治療應(yīng)用中具有潛在功效。通過動物體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，滴鼻給藥miR-130b可以明顯緩解臨床癥狀和病毒血癥，同時形成部分免疫保護(hù)效果。
　　本論文的最后部分，我們通過深度測序鑒定了PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后miRNA表達(dá)譜，并進(jìn)行了差異分析。結(jié)果可以看出，類似很多物種，miR-21是MARC-145細(xì)胞中含量最豐富的miRNA。PRRSV感染后，可以對MARC-145內(nèi)源的miRNA表達(dá)產(chǎn)生影響。

7、已經(jīng)確定了多種細(xì)胞miRNA，其表達(dá)在PRRSV感染后發(fā)生顯著改變，其中很多miRNA在前人研究中與機體先天性免疫等息息相關(guān)。這表明，miRNA可能在PRRSV復(fù)制和宿主防御感染中發(fā)揮著功能。在PRRSV基因組序列范圍內(nèi)，我們沒有找到任何潛在的miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)存在的證據(jù)。根據(jù)不同miRNA在細(xì)胞中的表達(dá)量，我們選取了六條分別呈高、中、低豐度表達(dá)的miRNA作為研究對象，利用北美型PRRSV全長感染性克隆pAPRRS的平臺，將miRNA

8、的反向互補序列插入PRRSV基因組3'UTR中，構(gòu)建了一系列PRRSV突變體，人工提供了與內(nèi)源性miRNA序列完全互補的結(jié)合位點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，插入let-7e結(jié)合位點后，可以在轉(zhuǎn)染后顯著抑制病毒產(chǎn)生的時間和復(fù)制的速率，但遺憾的是突變病毒遺傳不穩(wěn)定。盡管如此，我們還是獲得了一定試驗數(shù)據(jù)，插入互補結(jié)合位點也不失為利用內(nèi)源miRNA抑制PRRSV復(fù)制的一個研究思路，可通過更多嘗試以尋找一株復(fù)制能力較弱且穩(wěn)定遺傳的PRRSV，用于抗病毒治療的研究