轉(zhuǎn)基因高淀粉、高直鏈淀粉玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制及性狀分析.pdf

1、玉米是全世界第一大作物，是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料。在各種作物淀粉中，玉米淀粉具有最佳的化學(xué)組成，全球淀粉產(chǎn)量的80％左右為玉米淀粉。淀粉產(chǎn)量和淀粉組成結(jié)構(gòu)是影響淀粉業(yè)發(fā)展的兩大因素。在普通玉米籽粒中，淀粉含量一般在65％左右，而直鏈淀粉僅占總淀粉的25-30％。高淀粉玉米種植可明顯增加農(nóng)民收益;而高直鏈淀粉不僅具有重要的工業(yè)用途，也是一種具有保健功能的新型膳食纖維。因此，加強高淀粉和/或高直鏈淀粉玉米的培育有重大的社會效益和經(jīng)濟效益

2、。我國高直鏈淀粉玉米種質(zhì)資源十分缺乏，直鏈淀粉主要依賴以昂貴的價格進口。采用常規(guī)育種方法很難打破高直鏈淀粉性狀與其它不良籽粒性狀的連鎖關(guān)系。因此，利用轉(zhuǎn)基因手段創(chuàng)制高淀粉和/或高直鏈淀粉玉米新種質(zhì)受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。本論文以參與淀粉合成的關(guān)鍵酶基因為靶點，利用過表達或抑制表達的轉(zhuǎn)基因策略，開展了高淀粉玉米和高直鏈淀粉玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制。
　　SBEⅡRNAi轉(zhuǎn)基因玉米后代性狀分析
　　直鏈淀粉的合成是一個多酶催化的過程并且受

3、到復(fù)雜的基因-環(huán)境互作的影響。淀粉分支酶(SBE)在調(diào)控淀粉分支水平中起核心作用。不同SBE家族的同工酶在控制分支點數(shù)目、鏈長分布以及直鏈淀粉/支鏈淀粉比例中具有清晰的功能分工，其中SBEⅡb的活性大小直接影響玉米胚乳中直鏈淀粉的含量。
　　本工作首先對不同的SBEⅡRNAi結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)玉米株系進行了高直鏈淀粉性狀的遺傳穩(wěn)定性分析，研究了SBEⅡa和SBEⅡb活性的降低對直鏈淀粉含量、淀粉分支鏈鏈長分布和淀粉粒形態(tài)的影響。在前期工作中，

4、李寧等已通過分子檢測、表達分析以及直鏈淀粉含量的測定篩選出不同SBEⅡRNAi結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)玉米純合株系，論文中所涉及的10個hpSBEⅡRNA干擾結(jié)構(gòu)以ZmSBEⅡ亞家族為靶標，以達到抑制SBEⅡ活性的目的。這些干擾載體分為兩組，分別用組成型P35S啟動子或胚乳特異性啟動子P27kD啟動其表達。每組干擾載體中包含:兩個載體分別以893 bp(bc)或467 bp(bd)的SBEⅡb保守區(qū)序列為靶序列(相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系分別命名為P35bc、P3

5、5bd、P27bc、P27bd)，兩個載體分別以417 bp SBEⅡα特異區(qū)+295 bp SBEⅡb特異區(qū)的融合片段(ac)或417 bp SBEⅡα特異區(qū)+154 bp SBEⅡb特異區(qū)的融合片段(ad)作為干擾結(jié)構(gòu)的臂序列(相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系分別命名為P35ac、P35ad、P27ac、P27ad)，另外一個載體以893 bp的SBEⅡb保守區(qū)序列為靶序列并將干擾結(jié)構(gòu)中內(nèi)含子部分（chalcone synthase intron，

6、CHSA intron）用改造過的過氧化氫酶基因的第一個內(nèi)含子替換（相應(yīng)的株系命名為P35in'或P27in'）。凝膠滲透色譜法（GPC法）測定結(jié)果顯示，在各SBEⅡRNAi轉(zhuǎn)基因株系中，P27ac株系的籽粒直鏈淀粉含量增幅最大，占總淀粉含量的55.89％，幾乎是WT植株直鏈淀粉含量的2倍。P27ad株系的直鏈淀粉含量為51.95％，顯著高于P27bc和P27bd轉(zhuǎn)基因株系的直鏈淀粉含量（分別為46.24％和44.78％）。P27bc、

7、P27in'和P27ad株系的直鏈淀粉含量（分別為46.24％、48.26％和51.95％）均明顯高于其相應(yīng)的P35bc、P35in'和P35ad株系（分別為41.86％、45.31％和46.83％）。P35in'和P27in'轉(zhuǎn)基因株系的直鏈淀粉含量（分別為45.31％和48.26％）略高于P35bc和P27bc株系（分別為41.86％和46.24％，其hpRNA載體含有查爾酮合成酶內(nèi)含子）。并且直鏈淀粉含量的增加與各轉(zhuǎn)基因株系ZmS

8、BEⅡ基因表達量以及SBE酶活性成負相關(guān)（李寧2011）。這一測定結(jié)果與李寧等(2011)碘結(jié)合法測定的結(jié)果基本一致。GPC結(jié)果還顯示與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)SBEⅡRNAi結(jié)構(gòu)株系的籽粒淀粉脫分支后，F(xiàn)1組分包含更多且鏈長更長的直鏈淀粉分子，并且組分F2與F3的比例在轉(zhuǎn)基因株系中更高。即轉(zhuǎn)SBEⅡRNAi結(jié)構(gòu)玉米籽粒中，不僅直鏈淀粉含量顯著增加，而且支鏈淀粉中的支鏈的長度也明顯增加。
　　在轉(zhuǎn)SBEⅡRNAi結(jié)構(gòu)株系胚乳中，隨著直

9、鏈淀粉含量的提高，淀粉粒的形態(tài)也發(fā)生了明顯變化，如表面呈現(xiàn)不規(guī)則的塌陷，淀粉粒大小不均一等特征。在以ZmSBEⅡ保守區(qū)域為干擾靶序列的轉(zhuǎn)基因株系P35bc、P35in'、P27bc、P27bd和P27in'中，淀粉粒表面呈現(xiàn)出輕微的不規(guī)則突起，有的變?yōu)槎嘟切?而P35ad、P27ac和P27ad株系中淀粉粒表面呈現(xiàn)出較多的凹陷。這些結(jié)果表明，淀粉組成成分比例的改變顯著影響了淀粉粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時也會影響籽粒中粉質(zhì)胚乳和角質(zhì)胚乳的比例。相

10、比于WT植株，各轉(zhuǎn)基因株系的籽粒大小有不同程度的降低，并且與直鏈淀粉含量成負相關(guān)。但是，轉(zhuǎn)基因株系的籽粒未發(fā)生嚴重的皺縮，籽粒性狀明顯不顯著，基本保持了受體自交系楔形馬齒狀籽粒形態(tài)。
　　本工作利用重疊引物延伸法獲得了突變型AGPase大亞基編碼基因Sh2r6hs，選用玉米胚乳特異性啟動子P22kD和P27kD分別驅(qū)動Sh2r6hs基因和Bt2基因的表達，構(gòu)建出Sh2r6hs單基因過表達載體和與Bt2基因串聯(lián)的過表達植物載體，采用

11、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米芽尖轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入優(yōu)良自交系昌7-2和鄭58。 PCR和real-time RT-PCR檢測證明，外源基因在轉(zhuǎn)基因玉米株系中穩(wěn)定遺傳，且表達穩(wěn)定。經(jīng)多代篩選，選擇出純合株系用以研究Sh2r6hs以及Bt2過表達對玉米胚乳中AGPase酶活性、淀粉合成、籽粒表型及產(chǎn)量的影響。
　　從不同灌漿時期(10、15、20、25 DAP)的果穗剝?nèi)∽蚜＃瑢δ繕嘶虻谋磉_水平和AGPase酶活性進行分析。各株系中Sh2和Bt2的表

12、達豐度隨著灌漿時間的增加而增加，在授粉后20天時達到最高峰，繼而降低。相比于未轉(zhuǎn)基因受體自交系，入選的各轉(zhuǎn)基因株系目標基因的表達強度均明顯提高，增加幅度在不同株系間有差異。AGPase活性也隨著灌漿的進程而增加，在授粉后20天達到最高峰，隨后下降。入選的轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)GPase酶活性明顯高于受體自交系的。轉(zhuǎn)雙基因株系的酶活性也明顯高于轉(zhuǎn)單一Sh2r6hs基因株系的。測定授粉后20天籽粒AGPase酶活性，發(fā)現(xiàn)在45℃下各株系A(chǔ)GPase活

13、性較30℃時降低。
　　對轉(zhuǎn)基因純合植株及其受體自交系的成熟籽粒進行淀粉含量和百粒重測定，發(fā)現(xiàn)與受體自交系昌7-2相比，Sh2r6hs-C-250植株的籽粒淀粉含量由昌7-2的64.18％增加到70.40％，差異達到顯著水平;雙基因串聯(lián)的轉(zhuǎn)基因株系Sh2r6hsBt2-C-47的籽粒淀粉含量增加到77.05％;在鄭58背景下，雙基因串聯(lián)的轉(zhuǎn)基因株系的淀粉含量由昌7-2的64.9％增加到Sh2r6hsBt2-Z-80株系的77.36

14、％。
　　本工作中，過表達突變型大亞基基因Sh2r6hs或與Bt2基因共表達都能夠提高胚乳AGPase活性、淀粉含量和籽粒產(chǎn)量，雙基因過表達時淀粉含量和籽粒產(chǎn)量相對增加更高。Sh2r6hs基因與Bt2基因共表達可形成更多的穩(wěn)定四聚體，減輕高溫脅迫和Pi對AGPase活性的抑制，促使更多的可溶性糖類被合成淀粉，拉動碳水化合物從“源組織”向“庫組織”分配，導(dǎo)致籽粒產(chǎn)量增加。本工作采用Sh2r6hs基因代替Sh2基因的策略進行過表達材料

15、的創(chuàng)制，既可有效地減輕抑制因子對AGPase活性的影響，增加淀粉合成，又能促進果穗及籽粒性狀的改變，為培育玉米優(yōu)良自交系提供了一個切實可行的途徑。
　　過表達GBSSⅠ提高籽粒直鏈淀粉含量和產(chǎn)量
　　直鏈淀粉主要是由顆粒結(jié)合型淀粉合成酶GBSSⅠ負責(zé)合成的。GBSSⅠ功能的完全缺失將導(dǎo)致直鏈淀粉含量嚴重降低，甚至致使淀粉中僅含有100％的支鏈淀粉。在玉米胚乳中過表達GBSSⅠ編碼基因Zm Wx有望提高GBSSⅠ的活性，增加直

16、連淀粉合成。
　　本工作采用RT-PCR方法從玉米胚乳cDNA中克隆出玉米GBSSⅠ編碼基因ZmWx，選用玉米胚乳特異性啟動子P27kD驅(qū)動其表達，以除草劑抗性基因αls為選擇標記，構(gòu)建出ZmWx單基因過表達的植物轉(zhuǎn)化載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米芽尖遺傳轉(zhuǎn)化方法，將其轉(zhuǎn)入玉米骨干自交系昌7-2和鄭58。
　　綜上所述，本論文工作對采用RNAi技術(shù)獲得的高直鏈淀粉玉米后代的胚乳淀粉組成和淀粉粒形態(tài)進行了分析，進一步肯定了不同RN

17、Ai結(jié)構(gòu)對靶基因表達的抑制效果;檢測了高直鏈淀粉性狀的遺傳穩(wěn)定性，獲得了高直鏈淀粉玉米新種質(zhì)。同時，利用過表達突變型AGPase大小亞基的方法創(chuàng)制出淀粉含量和籽粒體積顯著增加的高淀粉玉米新種質(zhì);利用過表達ZmWx基因的方法提高了玉米籽粒直鏈淀粉的合成，獲得淀粉含量和直鏈淀粉含量顯著增加的轉(zhuǎn)基因玉米新種質(zhì)，并通過雜交聚合的方式實現(xiàn)過表達突變型AGPase基因和Zm Wx基因在玉米胚乳中共表達，為進一步選育高淀粉、高直鏈淀粉玉米種質(zhì)提供了優(yōu)