羽扇豆醇對肝癌細胞的抑制作用及其機制研究.pdf

1、目的:研究三萜類化合物羽扇豆醇對肝癌細胞的生長抑制作用和凋亡誘導效應，并探討羽扇豆醇抗肝癌效應的作用機制。 方法:1.用RT-PCR和Western Blot法檢測DR3在肝癌細胞HepG2，SMMC7721以及肝正常細胞株Chang 1ivet的表達。2.不同濃度的羽扇豆醇(1-200μmol/L)作用于肝癌細胞株HepG2，SMMC7721以及肝正常細胞株Chang liver48小時，用MTT法測定羽扇豆醇對肝癌細胞的生長

2、抑制作用。選用0，15，25和35μmol/L的羽扇豆醇進行進一步的研究。不同濃度的羽扇豆醇作用于SMMC7721細胞48小時之后：Hoechst33258染色后熒光顯微鏡下觀察有無細胞凋亡，流式細胞儀法檢測凋亡和確定凋亡率；Western Blot法檢測Caspase3，Caspase9蛋白的表達變化：用Caspase8阻斷劑觀察對羽扇豆醇誘導凋亡的阻斷效應。3.為了探討羽扇豆醇的作用機制，用RT-PCR法檢測DR3、Fas、DR5等

3、死亡受體及死亡相關受體相關蛋白FADD，TRADD mRNA的表達：Western Blot法同時對DR3和Fas的蛋白表達進一步分析研究。此外，用Western Blot法檢測Bcl-2，Bax，p53和NF-κB/p65等蛋白的表達變化；用RT-PCR法檢測p53和NF-κB/p65 mRNA的表達。4.用DR3單克隆抗體預處理肝癌細胞1小時后，觀察DR3單克隆抗體與DR3交聯(lián)后對肝癌細胞生長和凋亡有無影響，觀察對羽扇豆醇的細胞凋亡

4、誘導作用有無影響。 結果:1.在蛋白水平和mRNA水平，肝癌細胞株DR3的表達明顯高于正常肝細胞。2.羽扇豆醇對肝癌細胞具有生長抑制和誘導凋亡的作用。 (1)MTT試驗證實羽扇豆醇對肝癌細胞的增殖抑制效應具有濃度依賴關系。羽扇豆醇作用48小時后，與對照組相比，各濃度組的細胞活力有統(tǒng)計學意義上的顯著差別(P<0.05)。不同濃度組之間的細胞活力也有統(tǒng)計學意義上顯著差別(P<0.05)。(2)0，15，25，35μmol/L的羽扇豆

5、醇作用48小時后，SMMC7721細胞經Hochest33258法染色，在熒光顯微鏡下可以觀察到凋亡現(xiàn)象：細胞體積縮小，染色質濃縮，并見核碎裂，凋亡小體出現(xiàn)。 (3)通過流式細胞技術顯示，不同濃度的羽扇豆醇作用48小時后，肝癌細胞SMMC7721發(fā)生了凋亡，凋亡率分別為0.3％，8.1％，15.7％和33％。 (4)Western Blot檢測證實，0，15，25，35μmol/L的羽扇豆醇作用于SMMC7721細胞48h后，Caspa

6、se3酶原表達水平下降，活性形式增加。3.對死亡受體及其相關蛋白的表達影響。(1)RT-PCR檢測證實，羽扇豆醇作用于肝癌細胞后：DR3mRNA表達受到抑制，F(xiàn)asmRNA表達未檢測到。(2)Western Blot檢測證實，DR3表達受到抑制，并且與濃度成依賴關系。Fas表達在SMMC7721細胞缺失，經羽扇豆醇處理也不能誘導表達。 (3)死亡受體相關蛋白FADDmRNA表達增加。TRADDmRNA無明顯變化。(4)Caspase8阻

7、斷劑能夠部分阻斷羽扇豆醇的效應：減弱羽扇豆醇誘導的生長抑制、凋亡和Caspase3的表達。(5)DR3單克隆抗體預處理不能誘導肝癌細胞SMMC7721發(fā)生凋亡，然而預處理能夠部分拮抗羽扇豆醇誘導的細胞凋亡和Caspase3酶的激活。4.對線粒體通路相關分子和基因的影響。(1)Western Blot檢測證實，0，15，25，35μmol/L羽扇豆醇作用48h后，Caspase9表達增加；線粒體凋亡相關蛋白Bcl-2表達下降，Bax表達沒

8、有明顯變化。p53表達增加，NF-kB/p65表達下降。 (2)RT-PCR檢測證實， Bcl-2 mRNA表達下降，未檢測到BaxmRNA表達。p53 mRNA表達增加，然而NF-kBmRNA表達受到抑制。 結論: 1.羽扇豆醇對肝癌細胞具有生長抑制和凋亡誘導作用。 2.抑制DR3的表達是其主要機制之一，DR3可能是羽扇豆醇抗肝癌作用的一個重要靶標分子。3.羽扇豆醇可能還通過抑制NF-K B表達和增強P53表達，下調Bcl-2