蜜蜂球囊菌cDNA文庫的構建及胞外酶的定性研究.pdf

1、蜜蜂白堊病(bee chalkbrood disease)是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)引起的真菌性傳染病，主要感染蜜蜂幼蟲。白堊病是我國養(yǎng)蜂業(yè)中潛在病害之一，影響著我國養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展。目前國內外對蜜蜂球囊菌的研究主要集中在病原的生物學特性、最適培養(yǎng)條件、發(fā)病流行規(guī)律、病理學、病情的診斷等方面，由于蜜蜂球囊菌的致病機理不明，不能在生產中有效的預防和治療蜜蜂白堊病。 本研究采用Stratagene公司的ZAP E

2、epress R cDNA Synthesis Kit and ZAP Express R cDNA Gigapack R III Gold Cloning Kit試劑盒，構建了蜜蜂球囊菌cDNA文庫。文庫滴度測定為106 pfu·mL-1，擴增后的滴度是109 pfu·mL-1；噬菌體的轉化后，藍白斑篩選單菌落，重組率達到90％。這為后續(xù)工作的進行打下良好的基礎。昆蟲中腸圍食膜主要由蛋白質、幾丁質和糖類等組成。蜜蜂球囊菌通過分泌胞外蛋

3、白酶、幾丁質酶、酯酶和淀粉酶等破壞蜜蜂幼蟲中腸圍食膜侵染蜜蜂；本試驗對幾種常見的蛋白酶、酯酶和淀粉酶分別進行活性染色和銀染，結果顯示：蜜蜂球囊菌能夠胞外分泌蛋白酶、酯酶和淀粉酶。在SDS-PAGE條件下，蛋白酶活性染色有兩條條帶，分子量為37.0 kDa和110.0 kDa；酯酶活性染色鑒定出三條帶，分子量是14.1 kDa、20.1 kDa、29.0 kDa。在PAGE條件下，蛋白酶有兩條條帶，分子量為48.0 kDa和94.0 kD

4、a；酯酶活性鑒定出一條帶，分子量是35.0kDa淀粉酶活性鑒定出至少三條帶，分子量為90.0 kDa、97.2 kDa和大于97.0 kDa。 此外，本研究還對球囊菌分泌幾丁質酶的情況進行了探索。利用蜜蜂球囊菌胞外分泌物(幾丁質結合蛋白)結合膠體幾丁質(N-乙酰葡糖氨)，設計不同結合時間、不同緩沖體系，進行結合蛋白試驗，然后結合后進行Loading buffer和Calcofluor(M2R)處理；pH 7.4條件下結合6 d，