分枝桿菌噬菌體Chy2生物擴(kuò)增法的建立及其檢測(cè)效果的評(píng)價(jià).pdf

1、目的：
　　結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的公共傳染性疾病，具有高感染率、高患病率和高病死率的特點(diǎn)。早期發(fā)現(xiàn)、快速診斷結(jié)核病，從而及時(shí)給予有效的藥物治療是減少結(jié)核病傳播機(jī)會(huì)，控制疫情蔓延的重要手段。噬菌體生物擴(kuò)增法是用分枝桿菌噬菌體D29快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌活菌建立的病原學(xué)表型檢測(cè)技術(shù)。該方法成本低、操作簡(jiǎn)易、檢測(cè)特異性高、48小時(shí)即可報(bào)告結(jié)果，具有廣闊的開(kāi)發(fā)空間和巨大的應(yīng)用潛能，尤其適合在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)、經(jīng)濟(jì)水平相對(duì)滯后的發(fā)展中國(guó)家和地

2、區(qū)推廣使用。然而，噬菌體生物擴(kuò)增法最大的缺陷是檢測(cè)靈敏度低，成為遏制該技術(shù)推廣應(yīng)用的瓶頸。
　　本課題組在國(guó)家“十一五”重大科技專項(xiàng)課題的前期研究中，自我院結(jié)核病房的花盆泥土發(fā)現(xiàn)1株分枝桿菌噬菌體，經(jīng)分離、純化，對(duì)其生物學(xué)特性、遺傳背景、全基因組序列進(jìn)行全面分析，證明是一種新結(jié)核分枝桿菌噬菌體，命名為Chy2。本研究針對(duì)噬菌體生物擴(kuò)增法的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，探索Chy2應(yīng)用于生物擴(kuò)增法的技術(shù)條件，擬建立噬菌體Chy2生物擴(kuò)增法（Chy2

3、-PhaB）;初步探討Chy2-PhaB對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)效果，為進(jìn)一步發(fā)掘噬菌體Chy2的臨床應(yīng)用價(jià)值，優(yōu)化噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)技術(shù)、提升其檢測(cè)效能提供科學(xué)理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、液體培養(yǎng)法培養(yǎng)恥垢分枝桿菌，羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌濃度，雙層平板培養(yǎng)法擴(kuò)增噬菌體，小平板法測(cè)定噬菌體滴度。
　　2、噬菌斑點(diǎn)測(cè)法觀察噬菌體殺滅劑滅活噬菌體Chy2的最低濃度和最短時(shí)間，確定其作用時(shí)間和

4、工作濃度。
　　3、噬菌斑計(jì)數(shù)法確定Chy2與結(jié)核分枝桿菌孵育達(dá)到最高感染率的感染時(shí)間和感染滴度。
　　4、收集并處理58份臨床痰液標(biāo)本，分別用噬菌體Chy2和D29生物擴(kuò)增法檢測(cè)痰液標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，同時(shí)以改良羅氏培養(yǎng)法作診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比評(píng)價(jià)兩種噬菌體生物擴(kuò)增法的檢測(cè)效能。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)培養(yǎng)后，恥垢分枝桿菌濃度為4.5×109CFU/ml，結(jié)核分枝桿菌濃度為3×108 CFU/ml;經(jīng)擴(kuò)增后，Chy

5、2滴度為2.2×1011PFU/ml，D29滴度為1.9×1011PFU/ml。
　　2、最低6％硫酸亞鐵銨溶液與Chy2作用最短5min可徹底滅活宿主菌體外的游離Chy2。
　　3、Chy2滴度為2.2×1011CFU/mL，與結(jié)核分枝桿菌孵育240min，感染效率最高。
　　4、Chy2-PhaB對(duì)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)靈敏度、特異性、Youden指數(shù)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為94.7％、85.0％、0.7