蘇云金芽孢桿菌WB7幾丁質(zhì)酶定點(diǎn)突變研究.pdf

1、幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)以β-1，4糖苷鍵連接而成的直鏈狀高分子生物多聚體，是昆蟲(chóng)表皮、骨骼及中腸圍食膜的組成成分。幾丁質(zhì)酶可催化降解幾丁質(zhì)的β-1，4糖苷鍵，破壞昆蟲(chóng)圍食膜并干擾昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，所以引起人們的重視。本研究通過(guò)對(duì)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)WB7菌株幾丁質(zhì)酶催化區(qū)的活性位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了12個(gè)突變體pET-F201L、pET-F201Y、pET-G

2、203A、pET-G203D、pET-D205E、pET-D205N、pET-D207E、pET-D207N、pET-W208C、pET-W208R、pET-E209D和pET-E209Q，從而研究酶活性中心功能基團(tuán)在酶催化中的作用機(jī)制。 結(jié)果表明，突變體pET-F201L、pET-G203D、pET-D205N、pET-D207E、pET-D207N、pET-W208C和pET-E209D在各測(cè)活條件下均完全失活，而pET-F

3、201Y的酶活力下降了72％，pET-G203A酶活力下降了70％，pET-D205E酶活力是野生型的52％，pET-W208R的酶活力是野生型的69％，pET-E209Q的酶活力是所有突變體中最高的，是野生型的71％。pH-酶活曲線表明，pET-F201Y、pET-G203A與pET-D205E作用的pH范圍變窄了，與野生型相比，pET-D205E的有效pH范圍縮小了一個(gè)單位，而pET-F20lY與pET-G203A則縮小了2個(gè)單位。

4、幾個(gè)仍有酶活的突變體及野生型幾丁質(zhì)酶作用的最適pH均為8.0。從溫度-酶活曲線可以看出，突變體pET-G203A的熱穩(wěn)定性下降了，其作用的最適溫度為50℃，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，酶活急劇下降，而野生型幾丁質(zhì)酶及其它突變體作用的最適溫度為60℃，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，酶活迅速下降。 G203在幾丁質(zhì)酶催化中的作用可能是維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)；D207可能在反應(yīng)過(guò)程中離子化，其所帶的負(fù)電荷通過(guò)形成一對(duì)離子對(duì)，從而使反應(yīng)過(guò)程中生成的帶正電荷