球孢白僵菌AMPK蛋白激酶基因BbSNF1和α-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BbAGT1的功能分析.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作為昆蟲病原微生物，不僅在農(nóng)業(yè)害蟲防治方面有著極其重要的應(yīng)用潛力，同時(shí)還是研究真菌生長發(fā)育及其致病機(jī)制的良好模型。
　　本文主要研究了球孢白僵菌AMPK蛋白激酶BbSNF1調(diào)控生長發(fā)育與致病力的機(jī)制以及補(bǔ)充研究了α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)基因BbAGT1在對(duì)生防真菌球孢白僵菌碳源利用、產(chǎn)孢以及毒力方面的影響，研究結(jié)果如下。
　　球孢白僵菌AMPK蛋白激酶BbSNF1的功能研究 AMPK

2、蛋白激酶在真菌中高度保守，球孢白僵菌BbSNF1基因編碼區(qū)全長2230bp，編碼702個(gè)氨基酸，包括一個(gè)在SNF1所有同源蛋白中存在的PKinase結(jié)構(gòu)域。為進(jìn)一步鑒定球孢白僵菌BbSNF1的功能，我們構(gòu)建了基因敲除菌株和回補(bǔ)菌株。通過與野生菌株和回補(bǔ)菌株的表型對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在菌株生長方面，敲除菌株△BbSNF1在八種不同碳源和四種不同氮源培養(yǎng)基上生長明顯減弱;代謝方面，在不同碳源培養(yǎng)基中，尤其是在葡萄糖、蔗糖和海藻糖作為唯一碳源培養(yǎng)時(shí)，敲

3、除菌株培養(yǎng)液液酸度增加明顯;并且在測(cè)定菌液中四種有機(jī)酸含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，敲除菌株的乳酸、丙酮酸以及檸檬酸的含量增加，而草酸的含量降低;產(chǎn)孢能力方面，分別以SDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以CZA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，敲除株的分生孢子量下降趨勢(shì)明顯，且在產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)方面，BbSNF1基因的敲除明顯延緩了產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形成時(shí)間及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài);在菌株毒力方面，分別進(jìn)行體表浸泡法處理和血腔注射法處理時(shí)，敲除菌株相比野生株其半致死時(shí)間分別延長了75％和25％，導(dǎo)致昆蟲毒力的下

4、降;在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄方面，被檢測(cè)的17個(gè)編碼幾丁質(zhì)酶的基因表達(dá)量中13個(gè)呈下調(diào)趨勢(shì)，48個(gè)編碼蛋白水解酶的基因中有18個(gè)明顯抑制，海藻糖為碳源的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)錄的14個(gè)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因中表達(dá)量上調(diào)的有9個(gè)，蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)錄的14個(gè)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因中表達(dá)量上調(diào)的有8個(gè)，此外，當(dāng)以葡萄糖為碳源培養(yǎng)時(shí)，在檢測(cè)的40個(gè)糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因中有31個(gè)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，以海藻糖為碳源培養(yǎng)時(shí)，糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因也有28個(gè)表達(dá)量下降。由此可見，球孢白僵菌蛋白激

5、酶BbSNF1在調(diào)控球孢白僵菌的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝，尤其是菌株毒力方面有著重要的作用。
　　球孢白僵菌的芽生孢子作為另一種可侵染的細(xì)胞形式，在病原真菌侵染過程中有著不可替代的作用。本文研究了在有機(jī)氮源和無機(jī)氮源的培養(yǎng)下BbSNF1調(diào)控球孢白僵菌芽生孢子的生長發(fā)育的情況。研究結(jié)果表明，在兩種培養(yǎng)條件下敲除菌株相對(duì)野生菌株而言芽生孢子的產(chǎn)量和生物量都呈下降趨勢(shì)，并且有機(jī)氮源培養(yǎng)時(shí)敲除株的芽生孢子個(gè)體更小。對(duì)野生株、敲除株和回補(bǔ)菌株的芽

6、生孢子產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，敲除菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的更晚，且萌發(fā)形態(tài)有不同程度的變異。昆蟲體內(nèi)芽生孢子形態(tài)的觀察結(jié)果顯示，敲除菌株細(xì)胞呈現(xiàn)生長較弱狀態(tài)，易被昆蟲血細(xì)胞吞噬。由此可見，球孢白僵菌BbSNF1在調(diào)控芽生孢子的生長發(fā)育方面有著重要的作用。
　　α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BbAGT1調(diào)控球孢白僵菌生長、產(chǎn)孢以及毒力絲狀真菌中糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在介導(dǎo)真菌吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)生長方面，起著重要的作用。海藻糖是昆蟲血淋巴中的主要碳源，因而昆蟲病原

7、真菌對(duì)海藻糖的利用能力是決定其在昆蟲血腔內(nèi)成功定殖、致病的重要因素之一。本文在前人構(gòu)建了敲除菌株△BbAGT1的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了回補(bǔ)菌株，并補(bǔ)充分析了球孢白僵菌中α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BbAGT1的功能。生物學(xué)表型分析表明BbAGT1基因的缺失導(dǎo)致了孢子萌發(fā)以及不同碳源上生長和產(chǎn)孢能力的減弱。昆蟲毒力實(shí)驗(yàn)表明傳統(tǒng)浸泡處理和昆蟲體腔注射處理時(shí)，敲除菌株△BbAGT1對(duì)昆蟲大蠟螟致死時(shí)間較野生菌株更長，即引起毒力的下降?；蜣D(zhuǎn)錄分析揭示了B