鼠抗人CCR3抗體的制備以及對(duì)哮喘治療作用的研究.pdf

1、過(guò)敏性哮喘是一種以氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性(AHR)、可逆性氣道阻塞和粘液高分泌為特征的氣道慢性疾病,病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚不明確.近年來(lái)的研究顯示,Eos是哮喘發(fā)病過(guò)程中主要的炎癥細(xì)胞.過(guò)敏性哮喘發(fā)病時(shí),抗原提呈細(xì)胞將抗原傳遞給T淋巴細(xì)胞并激活Th2細(xì)胞,后者釋放炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和趨化因子如白介素4(IL-4)、IL-5、Eotaxin等引起Eos在氣道的募集和活化.Eos不僅可分泌血小板活化因子、白三烯等炎癥因子,引起支氣管平滑肌

2、痙攣、氣管微血管通透性增加、氣道粘膜水腫等反應(yīng):激活的Eos還可釋放嗜酸細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、主堿基蛋白、嗜酸細(xì)胞神經(jīng)毒素、嗜酸細(xì)胞過(guò)氧化酶等對(duì)上皮細(xì)胞產(chǎn)生直接而顯著的細(xì)胞毒作用,使氣道上皮細(xì)胞壞死脫落,基底層細(xì)胞暴露,神經(jīng)末梢裸露,從而產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性.在哮喘患者的血、痰、支氣管肺泡灌洗液(BA[.F)中均可見Eos的升高. 趨化因子是一類結(jié)構(gòu)相似、分子量約為8-10KD,具有趨化功能的重要的細(xì)胞因子,通過(guò)作用于靶細(xì)胞表面的趨化因子受體發(fā)揮

3、生物學(xué)效應(yīng).根據(jù)半胱胺酸的相鄰位置關(guān)系分為多個(gè)亞族.其中C-C亞族在氣道炎癥性疾病中有著重要的作用.Eotaxin屬于CC類趨化因子,通過(guò)唯一的受體CCR3特異的強(qiáng)有力的誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞向特定組織遷移.其對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞具有高度的選擇性,在趨化嗜酸性粒細(xì)胞參與哮喘氣道炎癥過(guò)程中具有重要的作用.CCR3(CC chemokine rceptor3)即CC趨化因子受體3,為一種受體蛋白,主要介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)包括Eotaxin、Eotaxin-2、E

4、otaxin-3、RANTES、MCP-3、MCP-4以及MIP-1等多種趨化因子的反應(yīng)并產(chǎn)生細(xì)胞遷移、活化等效應(yīng),其主要表達(dá)在嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞以及肥大細(xì)胞、TH2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上.Eotaxin等炎癥介質(zhì)通過(guò)CCR3激活Eos,吸引大量E0s遷移到氣道,導(dǎo)致氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生,引起哮喘的發(fā)作.因此,切斷該炎癥通路的信號(hào)傳導(dǎo)將抑制氣道炎癥的發(fā)生.抗CCR3抗體可與Eos表面的CCR3受體特異性結(jié)合,阻斷IL-5、Eo

5、taxin等炎癥因子對(duì)Eos的作用,使Eos無(wú)法向氣道聚集,避免了Eos對(duì)氣道的破壞和哮喘的發(fā)病. 研究目的 1.合成CCR3細(xì)胞外區(qū)NH2端多肽并以此多肽免疫小鼠,制備鼠抗人抗CCR3抗體. 2.研究抗CCR3抗體對(duì)哮喘氣道炎癥和粘液高分泌的治療作用. 研究方法 采用多肽合成儀經(jīng)"固相合成法"合成了CCR3細(xì)胞外區(qū)NH2端30個(gè)氨基酸的多肽序列為mttsldtvet fgttsyyddv gll

6、cekadtr,并進(jìn)行多肽偶聯(lián)和檢測(cè)序列.以該多肽對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫,免疫以后眼球取血測(cè)定血清效價(jià),血清里的抗體效價(jià)要在1:6250以上取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,篩選獲得陽(yáng)性克隆后產(chǎn)生并純化抗體. 選擇健康雄性的C57BL/6小鼠,6-8周齡,體重18-22,分為4組.哮喘模型組(Ova組):以卵白蛋白(Ova)作為抗原進(jìn)行兩次腹腔注射致敏(第0,14天)和三次霧化吸入激發(fā)(第24,25,26天).

7、抗CCR3抗體組(Anti-CCR3組):Ova致敏和激發(fā)同Ova組,每次激發(fā)前腹腔注射抗CCR3抗體(PBND03,3mg/Kg).非特異性IgG組(IgG組):Ova致敏和激發(fā)同Ova組,每次激發(fā)前腹腔注射非特異性IgG(3mg/Kg).空白對(duì)照組(Saline組):以生理鹽水代替Ova致敏和激發(fā).末次激發(fā)48小時(shí)行肺泡灌洗,細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞因子檢測(cè),肺組織病理檢查,MUC5AC基因表達(dá)檢測(cè). 研究結(jié)果 1.人CCR3

8、 NH2端30個(gè)氨基酸多肽的合成采用多肽合成儀經(jīng)固相合成法合成了人CCPO細(xì)胞外區(qū)NH2端30個(gè)氨基酸的多肽序列為mttsldtvet fgttsyyddv glicekadtr,檢測(cè)序列證實(shí)為目的序列. 2.Western-Blot檢測(cè)抗CCR3抗體特異性對(duì)雜交瘤細(xì)胞通過(guò)ELISA有限稀釋法篩選陽(yáng)性克隆,取陽(yáng)性克隆里的上清,通過(guò)篩選共得到7個(gè)克隆.為了確定我們所得的抗體是抗CCR3的特異性抗體,我們采用了表面有豐富的CCR3的

9、Daudi細(xì)胞破碎液對(duì)所制備的7個(gè)陽(yáng)性克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體進(jìn)行Western-Blot分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中三個(gè)克隆的抗體PBND03、PBND04、PBND05在特定的大小的位置上有明顯的顯色條帶,而其余4個(gè)克隆未見特異性條帶. 3.抗CCR3抗體的親和力檢測(cè)取PBND03、04、05細(xì)胞打腹水,得到腹水后取腹水,從中純化單抗.對(duì)純化好的抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)和濃度測(cè)定.結(jié)果為:PBND03親和力>1.28×10<'9>PBND04

10、.親和力≥2×10<'7>,PBND05親和力≥3.2×10<'8>;ELISA最佳工作濃度分別為:0.1μg、5μg、0.2μg;濃度分別為3.85mg/ml、2.63mg/ml、2.31ml.由于PBND03的親和力最高,該抗體進(jìn)一步被用于在哮喘小鼠動(dòng)物模型中研究對(duì)哮喘的治療作用. 4.抗CCR3抗體(PBND03)對(duì)BALF中炎癥細(xì)胞的影響Ova組中的炎癥細(xì)胞總數(shù)比Saline組中的明顯增高.和Ova.組相比,IgG組中的

11、炎癥細(xì)胞總數(shù)沒有明顯的變化,而Anti-CCR3組中的炎癥細(xì)胞總數(shù)明顯降低.分類計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,與Saline組相比較,Ova組中的Eos明顯增高.Anti-CCR3組中的Eos較Ova組明顯降低,而IgG組中的Eos與Ova組相比較卻沒有明顯變化.各組間巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均未見有顯著性差異. 5.抗CCR3抗體(PBND03)對(duì)Ova致敏和激發(fā)后導(dǎo)致的哮喘小鼠氣道炎癥的影響各組肺組織切片HE染色用來(lái)觀察哮喘小鼠的氣道炎癥浸潤(rùn)情況

12、以及抗CCR3抗體對(duì)氣道炎癥的抑制作用.Saline組:氣道上皮完整,纖毛排列整齊,杯狀細(xì)胞少見,基底層以及平滑肌層較薄,肺小血管內(nèi)皮光滑,血管、氣道周圍見極少量的炎癥細(xì)胞,以巨噬細(xì)胞為主,未見到嗜酸性粒細(xì)胞. Ova組:氣道上皮細(xì)胞增生肥大,上皮不完整,纖毛排列紊亂,上皮下基底層增厚,平滑肌肥大增生,氣道和血管周圍、肺泡隔內(nèi)見大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn).Anti-CCR3組:與Ova組相比,氣道和血管周圍炎癥明顯減低.IgG組:與Ova組相

13、比,氣道和血管周圍炎癥未見明顯減少. 6.抗CCR3抗體(PBND03)對(duì)Ova致敏和激發(fā)后導(dǎo)致的粘液高分泌的影響PAS 染色發(fā)現(xiàn):Saline組:氣道上皮完整,幾乎無(wú)杯狀細(xì)胞增生和粘液形成.Ova組:氣道上皮杯狀細(xì)胞增生肥大,并有粘液形成,上皮脫落不完整.Anti-CCR3組:與Ova組相比,氣道粘液分泌明顯減低.IgG組:與Ova組相比,粘液分泌未見明顯減少. 用粘液的儲(chǔ)備指數(shù)(MOR)和杯狀細(xì)胞的化生指數(shù)(HR)來(lái)

14、定量分析氣道粘液的形成,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ova組與Saline組相比較MOR和FIR均明顯增高.抗CCR3抗體可明顯減低Ova導(dǎo)致的MOR和HR增高,而非特異性IgG對(duì)Ova導(dǎo)致的MOR和HR增高無(wú)抑制作用. 7.抗CCR3抗體(PBND03) 對(duì) Ova 致敏和激發(fā)后導(dǎo)致氣道粘液素基因MUCSAC mRNA的表達(dá)的影響如圖6所示,Saline組于MUC5AC位置沒有出現(xiàn)條帶,而Ova組于MUC5AC位置出現(xiàn)明顯條帶.和Ova組相比較,

15、抗CCR3組在MUC5AC部位沒有出現(xiàn)明顯的條帶.IgG組在MUC5AC部位出現(xiàn)的條帶和Ova組相似.上述結(jié)果說(shuō)明Ova致敏和激發(fā)引起了氣道粘液素基因MUC5AC mRNA的表達(dá)的增高,而抗CCR3抗體抑制了Ova導(dǎo)致氣道粘液素基因MUC5AC mRNA表達(dá)的增高. 8.抗CCR3抗體(PBND03)對(duì)BALF中細(xì)胞因子水平的影響Ova組中IL-4較Saline組明顯增高,而抗CCR3組中的IL-4較Ova組明顯下降.Ova組中

16、的IFN-γ水平和Saline組相比明顯下降,但是和Ova組相比,抗CCR3組中的IFN-γ水平?jīng)]有明顯變化.IgG組中無(wú)論是IL-4還是IFN-γ水平與Ova組相比均無(wú)明顯變化.上述結(jié)果表明,抗CCR3抗體減少了Ova所致的肺部IL-4的水平增高,而對(duì)IFN-γ水平卻沒有影響. 結(jié)論 1.本研究合成了CCR3細(xì)胞外區(qū)NH2端多肽,并以此多肽免疫小鼠成功地獲得了鼠抗人抗CCR3抗體.2.本研究合成的鼠抗人抗CCR3抗體可