南美洲響尾蛇神經(jīng)毒素(Crotoxin)對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察南美洲響尾蛇神經(jīng)毒素（Crotoxin）對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌Eca-109細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制作用，體內(nèi)局部用藥對(duì)荷瘤裸鼠人食管癌Eca-109細(xì)胞移植瘤的抑制作用，探討南美洲響尾蛇神經(jīng)毒素（Crotoxin）的抗腫瘤作用及其可能的機(jī)制。
　　 方法：以人食管癌Eca-109細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體外培養(yǎng)人食管癌Eca-109細(xì)胞株，分別以不同濃度的Crotoxin及順鉑作用于Eca-109細(xì)胞，并設(shè)陰性對(duì)照組，通過(guò)四氮唑鹽還原

2、法（MTT）觀察Crotoxin對(duì)Eca-109細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，Hoechst33342染色后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核的變化，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Crotoxin對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）測(cè)定Crotoxin作用后Eca-109細(xì)胞內(nèi)BCL-2、P15及Caspase3-P17基因擴(kuò)增水平。裸小鼠肩背部皮下注射人食管癌 Eca-1

3、09細(xì)胞懸液，建立皮下移植瘤動(dòng)物模型，分對(duì)照組和Crotoxin組（Crotoxin組為以生理鹽水稀釋至濃度為25-100μg/kg的Crotoxin注射液，對(duì)照組為相同劑量的生理鹽水），均為瘤周皮下注射，隔日1次，共給藥10次，停藥后次日殺死所有動(dòng)物，比較移植瘤瘤重，計(jì)算抑瘤率；蛋白免疫印跡法（Westernblot）測(cè)定移植瘤內(nèi)BCL-2、P15及Caspase3-P17蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：Crotoxin對(duì)人食管癌

4、Eca-109細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，與順鉑比較，有相似甚至更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞效果（P<0.05），Crotoxin對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用，倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡下均能觀察到凋亡細(xì)胞的核固縮、染色質(zhì)邊集、核碎裂、凋亡小體形成等形態(tài)學(xué)特征。Crotoxin可引起Eca-109細(xì)胞內(nèi)P15、Caspase3-P17基因擴(kuò)增增加，BCL-2基因擴(kuò)增減少，流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到Eca-109細(xì)胞的凋亡峰，Crotoxin藥物濃

5、度越大，檢測(cè)到凋亡峰的時(shí)間越早，并有G1期細(xì)胞增多。Crotoxin對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞裸小鼠移植瘤生長(zhǎng)有抑制作用，抑瘤率為35.7％（Crotoxin50ug/ml組）；Western blot檢測(cè)到Crotoxin作用后瘤體標(biāo)本P15、Caspase3-P17蛋白表達(dá)升高，BCL-2蛋白表達(dá)降低
　　 結(jié)論：南美洲響尾蛇神經(jīng)毒素（Crotoxin）對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞體外生長(zhǎng)有抑制作用，其作用與誘導(dǎo)凋亡和G1