亞洲棉抗黃萎病基因GaVdr1的克隆及功能分析.pdf

1、大麗輪枝菌(Verticillium dahlia Kleb.)引起的棉花黃萎病是我國(guó)棉花生產(chǎn)過(guò)程中最主要的病害，可造成蕾、鈴的大量脫落，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)脫落成光桿，甚至死亡。黃萎病抗性資源主要存在亞洲棉和海島棉等野生種質(zhì)資源中，但由于回交選擇的和雜交的障礙，很難直接利用。番茄(Lycopersicon esculentum)的Ve1基因是第一個(gè)克隆的抗黃萎病基因，編碼一個(gè)表面受體類蛋白(Receptor like protein)。利用同源

2、克隆方法，相繼克隆了與番茄Ve基因同源的二倍體番茄的SlVe1、水茄的StVe、野生薄荷的mVe1、棉花Gbve1等基因。本研究從亞洲棉南陵小籽棉中克隆了一個(gè)表面受體蛋白基因GaVdr1，通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)及轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗病性鑒定，研究了GaVdr1基因在黃萎病抗性中的作用。通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中PR相關(guān)基因表達(dá)水平及活性氧積累、胼胝質(zhì)沉積、細(xì)胞凋亡等實(shí)驗(yàn)初步研究了GaVdr1基因的抗病機(jī)制。
　　本研究對(duì)亞洲棉

3、南陵小籽棉進(jìn)行黃萎病抗性鑒定，以感病棉花品種泗棉2號(hào)為對(duì)照，接種強(qiáng)致病力落葉型菌株V99124天，南陵小籽棉總病指為15.6，泗棉2號(hào)總病指為73.2，接種強(qiáng)致病力非落葉型菌株BP224天，南陵小籽棉總病指為30.6，泗棉2號(hào)總病指為71.7，表明南陵小籽棉對(duì)黃萎病具有較好的抗性。根據(jù)Genbank中一段棉花EST序列，從常抗棉D(zhuǎn)NA中擴(kuò)增出一條1kb的片段，再根據(jù)該片段擴(kuò)增5'和3'未知區(qū)域的genomewalking，根據(jù)genom

4、ewalking得到的序列與原來(lái)1 kb片段進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因全長(zhǎng)的引物，從南陵小籽棉中擴(kuò)增出GaVdr1基因。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和發(fā)現(xiàn)GaVdr1基因含有9個(gè)LRR保守結(jié)構(gòu)域，C端含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。相似性分析發(fā)現(xiàn)GaVdr1與番茄Ve1和Ve2的相似性分別為47％和44.9％。Real-time RT-PCR對(duì)GaVdr1基因進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)其受黃萎病菌株V991、BP2、JR22的誘導(dǎo)，表達(dá)量分別為對(duì)照的7倍、5.5倍

5、和6.5倍。
　　通過(guò)構(gòu)建GaVdr1的VIGS沉默載體，將南陵小籽棉的內(nèi)源GaVdr1基因沉默。利用Real-time RT-PCR進(jìn)行沉默效果分析，表明該基因表達(dá)量下降85％左右。對(duì)沉默株的抗病性鑒定表明，接種V991、BP2、JR2230天，沉默植株總病指分別為44.6、59.3、43.2;空載對(duì)照群體總病指分別為27.2、36.4、22.7，差異達(dá)到極顯著水平。構(gòu)建GaVdr1過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)黃萎病的

6、抗性顯著提高。接種V991、BP2、JR2224天，轉(zhuǎn)基因株系3的發(fā)病率分別為21.2％、18.3％、12.9％，株系22的發(fā)病率分別為25％、22.5％、13.8％，而野生型煙草發(fā)病率分別為58.3％、54.5％、55.9％。轉(zhuǎn)GaVdr1基因與野生型植株對(duì)黃萎病的抗性達(dá)到差異極顯著水平(p＜0.01)。將轉(zhuǎn)GaVdr1基因植株接種煙草疫霉pp025，發(fā)現(xiàn)其對(duì)煙草疫霉也具有抗性，接種48h，轉(zhuǎn) GaVdr1基因本植株的平均發(fā)病面積2.

7、38cm2，而野生型植株的平均發(fā)病面積為7.28cm2。對(duì)轉(zhuǎn)GaVdr1基因和野生型植株的防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的相對(duì)定量表達(dá)分析表明，黃萎菌誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)GaVdr1基因和野生型植株的PR相關(guān)基因都上調(diào)表達(dá)(PRb2-SA、ERF1-ET、LOX-JA)，但是轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)基因表達(dá)量更高。其中V991誘導(dǎo)1天后，轉(zhuǎn)GaVdr1基因植株中ERF1、PRb2-SA、LOX表達(dá)量分別上調(diào)22倍、80倍、27倍，此時(shí)WT植株分別上調(diào)10倍、10倍、2

8、1倍;BP2誘導(dǎo)3天后，轉(zhuǎn)GaVdr1基因煙草中ERF1、PRb2-SA、LOX表達(dá)量分別上調(diào)15.5倍、48倍、19倍，此時(shí)WT植株分別上調(diào)5倍、10倍、3.5倍;JR22誘導(dǎo)3天后，轉(zhuǎn)GaVdr1基因煙草中ERF1、PRb2-SA、LOX表達(dá)量分別上調(diào)15倍、40倍、17.5倍，此時(shí)WT植株分別上調(diào)12.5倍、14倍、10倍。同時(shí)檢測(cè)黃萎菌誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)GaVdr1基因植株中活性氧積累、胼胝質(zhì)沉積和細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)侵染部位轉(zhuǎn)GaVdr