PARP-1抑制劑對骨肉瘤細胞生物學活性的影響及其聯合順鉑對骨肉瘤細胞生長的抑制作用.pdf

1、第一部分
　　 目的:探討PARP-1 抑制劑3-aminobenzamide(3-AB)對骨肉瘤細胞U2OS 及MG63 增殖及凋亡的影響。
　　 方法:
　　 1.用含10％胎牛血清的McCoy's 5a Medium Modified 培養(yǎng)基培養(yǎng)U2OS細胞，含10％胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63細胞，鋪滿瓶底后傳代；
　　 2.將U2OS細胞種于96 孔板，設6組：空白組、對照組、5mM

2、 3-AB 刺激組、10 mM3-AB 刺激組、15mM 3-AB 刺激組、20mM 3-AB 刺激組，每組4個復孔，種3塊板，分別給予刺激24、48、72 h，按CCK-8 法檢測細胞增殖，計算抑制率；
　　 3.將MG-63細胞種于96 孔板，設5組：空白組、對照組、5mM 3-AB 刺激組、10 mM3-AB 刺激組、20mM 3-AB 刺激組，每組4個復孔，種3 塊板，分別給予刺激24h、48h、72 h，按CCK-8

3、法檢測吸光度值，計算細胞增殖抑制率；
　　 4.將U2OS細胞種于6 CM 培養(yǎng)皿中，接種6個皿，其中3 皿作為對照組給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，另3 皿在培養(yǎng)基中加入10mM的3-AB，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后每組各取一皿，按Annexin V-FITC 凋亡試劑盒說明書操作，上流式細胞儀測凋亡率；
　　 5.將MG-63細胞種于6 CM 培養(yǎng)皿中，接種8個皿，其中2 皿作為對照組給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，另6 皿在培養(yǎng)基

4、中分別加入5mM、10mM、20mM的3-AB，在培養(yǎng)24h、48h后每組各取一皿，按Annexin V-FITC 凋亡試劑盒說明書操作，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率；
　　 6.將U2OS細胞種于6CM的培養(yǎng)皿中，接種4個皿，其中一皿作為對照組，另三皿分別給予10mM的3-AB 刺激8h、12h、24h后，按caspase-3 活性測定試劑盒說明書提取蛋白測定caspase-3的活性；
　　 7.將U2OS細胞種于6CM

5、的培養(yǎng)皿中，接種4個皿，一皿作為對照，給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，另三皿培養(yǎng)基中加入10mM的3-AB，分別培養(yǎng)24h、48h、72h后提取細胞總蛋白，Western-blotting 檢測Bcl-2、Bax的表達。
　　 結果:
　　 1.3-AB 抑制骨肉瘤細胞U2OS的增殖，抑制率隨3-AB 濃度的升高而升高，隨時間的延長而升高；
　　 2.3-AB 抑制骨肉瘤細胞MG-63的增殖，抑制率隨3-AB 濃度的升高而升

6、高，隨時間的延長而升高；
　　 3.3-AB 促進骨肉瘤細胞U2OS的凋亡，凋亡率隨3-AB 刺激時間的延長而升高；
　　 4.3-AB 促進骨肉瘤細胞MG-63的凋亡，凋亡率隨3-AB 濃度的升高而升高，隨時間的延長而升高；
　　 5.3-AB 刺激8h、12h后caspase-3 活性增加，差異有顯著性，24h后caspase-3 活性與對照組比較無顯著性差異；
　　 6.3-AB 刺激24h、48h

7、、72h后，Bax表達量逐漸升高，Bcl-2表達量則在24h 及48h輕度升高，72h 降低。
　　 結論:PARP-1 抑制劑3-AB 能抑制骨肉瘤細胞的增殖，促進其凋亡。
　　 第二部分
　　 目的:探討PARP-1 抑制劑3-aminobenzamide(3-AB)對骨肉瘤細胞U2OS 遷移及侵襲的影響。
　　 方法:
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)U2OS細胞，鋪滿瓶底后傳代；
　　 2.將U

8、2OS細胞種于6 孔板中，待細胞鋪滿孔底后用槍頭在孔板底劃三道劃痕，PBS沖洗三次，然后將孔分為3組，分別給予完全培養(yǎng)基、含5mM 3-AB的培養(yǎng)基和含10mM 3-AB的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24h后觀察細胞遷移的距離；
　　 3.將U2OS細胞分為兩組，一組為對照組，給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，另一組給予10mM3-AB 處理24h，然后將細胞消化后重懸于含0.1％ BSA的無血清培養(yǎng)基中，加入鋪好matrigel的Transwell 小

9、室的上室，下室加入完全培養(yǎng)基，24h后棉棒除去基質膠，染色，顯微鏡下觀察穿過膜的細胞數。
　　 結果:
　　 1.3-AB 刺激后較對照組細胞遷移距離降低，且隨3-AB 濃度增加，遷移距離降低越明顯，差異有顯著性；
　　 2.3-AB 刺激后較對照組細胞穿過基底膜數量減少，差異有顯著性。
　　 結論:
　　 PARP-1 抑制劑3-AB 能抑制骨肉瘤細胞的遷移及侵襲能力。
　　 第三部分<

10、br>　　 目的:探討PARP-1 抑制劑3-aminobenzamide(3-AB)聯合順鉑對骨肉瘤細胞U2OS 生長的影響。
　　 方法:
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)U2OS細胞，鋪滿瓶底后傳代；
　　 2.將U2OS細胞接種于兩塊96 孔板中，分為順鉑處理板及順鉑聯合3-AB 處理板，每板設七組，分別為空白組、對照組、0.5μg/ml 順鉑加或不加3-AB組、1.0μg/ml順鉑加或不加3-AB組、1.5μg/m

11、l 順鉑加或不加3-AB組、2.0μg/ml 順鉑加或不加3-AB組、2.5μg/ml 順鉑加或不加3-AB組，分別在刺激48h后用CCK-8 法測吸光度值，并計算細胞存活率；
　　 3.將U2OS細胞接種于6CM 皿中，接種12個皿，分為4組：陰性對照組、3-AB 處理組、順鉑處理組、3-AB 聯合順鉑處理組，每組3 皿，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后收集細胞，PI 染色，上流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期的變化。

12、　　 結果:
　　 1.單純順鉑處理及與3-AB 聯合處理后細胞的存活率均隨順鉑濃度的增高而逐漸降低，單純順鉑處理IC50 為1.15003，聯合刺激組的IC50 為0.65254，增敏比為1.76；
　　 2.與對照組比較，經單純3-AB 處理，及3-AB與順鉑聯合處理后細胞的凋亡率均增加，而3-AB 聯合順鉑處理后細胞的凋亡率較單純3-AB 及單純順鉑處理的凋亡率高；
　　 3.與對照組比較，3-AB 處理